Định lượng eucalyptol bằng phương pháp sắc ký khí

Loading Preview

Sorry, preview is currently unavailable. You can download the paper by clicking the button above.

1.4.2.2. Phương pháp phân tích Sắc ký khí với detecơ khối phổ

Phổ khối lượng - MS (mass spectrometry) là phương pháp được sử dụng rộng rãi hiện nay trong nghiên cứu hóa học, môi trường, sinh học, độc học và rất nhiều ngành khoa học khác nhau,...

Nguyên tắc chung của phương pháp là khi cho các phân tử ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron có năng lượng cao thì từ các phân tử sẽ bật ra một hay 2 electron và nó trở thành các ion có điện tích +1 (chiếm tỷ lệ lớn) và +2

ABC + e → ABC+* + 2e (1)

ABC + e → ABC+2 + 3e (2)

Loại ion (1) được gọi là ion gốc hay ion phân tử.

Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dòng electron có năng lượng lớn thì chúng sẽ bị phá vỡ thành nhiều mảnh ion, thành các gốc hoặc các phân tử trung hòa khác nhau, quá trình này được gọi là quá trình phân mảnh (fragmentation)

ABC+* → A+ + BC*

ABC+* → AB+ + C*

AB+ → A+ + B

Năng lượng của quá trình phân mảnh chỉ vào khoảng 30-100 eV, cao hơn năng lượng ion hóa phân tử (8-15 eV). Quá trình biến các phân tử trung hòa thành các ion gọi là sự ion hóa. Các ion có khối lượng m và điện tích e, tỉ số m/e được gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định được xác suất có mặt của chúng rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng [5]. Việc so sánh phổ khối lượng của chất nghiên cứu với thư viện phổ được lưu giữ trong máy tính sẽ xác định được công thức cấu tạo của chất.

Như vậy với kỹ thuật phân tích GC/MS khi các chất trong hỗn hợp được tách ra khỏi nhau sau khi lần lượt đi ra khỏi cột sắc ký khí chúng đi vào hệ thống khối phổ. Khí mang sẽ được tách ra khỏi hỗn hợp và đi vào vùng chân không để được hút ra ngoài. Chất nghiên cứu sẽ được bắn phá để tạo thành các mảnh ion có số khối khác nhau sau đó sẽ thu được phổ khối lượng của từng chất, từ đó qua thư viện phổ sẽ xác định được công thức cấu tạo của chất.

1.5. Phương pháp đánh giá hoạt chất sinh học của chất

Phổ hoạt tính sinh học của chất (Biological activity spectra – BAS) mô tả sự sự phức hợp của các hiệu ứng dược lý, sinh lý học và cơ chế hóa sinh của các tác động đặc biệt (đột biến, sinh ung thư, quái thai) có thể biểu lộ trong các tương tác với hệ sinh thái của chất. BAS mô tả thuộc tính bên trong của chất phụ thuộc vào cấu trúc đặc biệt của nó. Một chất có thể có rất nhiều các hoạt tính sinh học khác nhau. Một số hoạt tính có thể được tìm thấy trong nghiên cứu lý thuyết, một số hoạt tính được phát hiện ra trong các thử nghiệm lâm sàng, một số hoạt tính được phát hiện trong nhiều năm kể từ khi chúng được sử dụng làm thuốc. Ví dụ như Fluorouracil có 10 hoạt tính được lần lượt khám phá ra kể từ năm 1962 đến 1997 được mô tả ở Bảng 4 [15].

Hoạt tính sinh học là kết quả của sự tương tác giữa hợp chất hóa học với thực thể sinh học. Trong nghiên cứu lâm sàng, thực thể sinh học là con người, trong nghiên cứu tiền lâm sàng nó được thử nghiệm trên cơ thể sống là động vật (in vivo) hoặc thử nghiệm trong ống nghiệm (in vitro). Hoạt tính sinh học phụ thuộc vào những nét đặc trưng của hợp chất (về cấu trúc phân tử và đặc tính hóa lý), thực thể sinh học (loài, tuổi, giới tính, ...) và cách tiến hành nghiên cứu (liều lượng, con đường nghiên cứu,..).

Bảng 4. Hoạt tính sinh học của Fluorouracil [15]

STT	Hoạt tính	Năm tìm ra
	Chống ung thư	1962
	Độc phôi	1966
	Kháng vi rút	1971
	Ức chế tổng hợp Thimidine Tiriphosphate	1971
	Ức chế chuyển hóa RNA	1980
	Ức chế tổng hợp protein	1987
	Điều chỉnh chất chuyển hóa Lipit	1990
	Ức chế miễn dịch	1990
	Ức chế chất chuyển hóa	1991
	Kháng vi rút	1996

Nhiều chất có phổ hoạt tính sinh học rộng với nhiều hiệu ứng khác nhau. Một số hiệu ứng được sử dụng trong điều trị bệnh nhưng cũng có một số hiệu ứng có gây độc. Tổ hợp tất cả các hiệu ứng sinh học của chất gây ra đối với các thực thể sinh học được gọi là phổ hoạt tính sinh học của chất . Phổ hoạt tính sinh học có 4535 hoạt tính sinh học bao gồm các hiệu ứng dược lý cơ bản, cơ chế tác động và các độc tính đặc trưng.

Như vậy để xác định chính xác được hoạt tính sinh học của một chất thì nghiên cứu cuối cùng phải tiến hành đưa chất đó vào thử nghiệm. Tuy nhiên một chất có thể có rất nhiều các hoạt tính sinh học khác nhau và có những hoạt tính mà nó chưa có điều kiện được bộc lộ, do vậy các nhà nghiên cứu hóa sinh sẽ gặp rất nhiều khó khăn để tìm ra các hoạt tính bằng con đường thử nghiệm lâm sàng. Vì vậy nếu bằng tính toán mà có thể dự đoán được hoạt tính sinh học của chất thì nó là cơ sở lý thuyết rất quan trọng và giảm bớt được rất nhiều công sức cho các nhà nghiên cứu hóa sinh khi đưa vào thử nghiệm lâm sàng trên sinh vật.

Để dự đoán phổ hoạt tính sinh học của chất (BAS) hiện nay người ta sử dụng phầm mền tính toán PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) dựa trên quan điểm cho rằng hoạt tính là hàm của cấu trúc phân tử của chất (Activity=f(Structure)). Do vậy việc so sánh cấu trúc của một hợp chất cần nghiên cứu với cấu trúc của các chất có hoạt tính sinh học đã biết thì hoạt tính sinh học của chất mới có thể xác định được nếu như chất mới có tác dụng đặc biệt.
Chương 2

MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là:

- Đánh giá được đặc tính thành phần hóa học tinh dầu trong lá một số loài Bạch đàn trồng ở Miền Bắc Việt Nam;

- Bước đầu xác định, đánh giá mối liên hệ của thành phần chất trong tinh dầu Bạch đàn với một số vấn đề sinh thái môi trường.

2.2. Đối tượng và giới hạn nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận văn là tinh dầu trong lá của ba loài Bạch đàn: Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis); Bạch đàn xanh (Eucalyptus globulus) và Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora) được trồng tại miền Bắc Việt Nam. Mỗi một loài Bạch đàn nghiên cứu ở một cấp tuổi và tại một thời điểm nhất định trong năm.

2.3. Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được các mục tiêu trên đề tài tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

1. Khảo sát các phương pháp tách chiết tinh dầu từ lá Bạch đàn;

2. Xác định và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chất chính có trong tinh dầu các loài Bạch đàn nghiên cứu;

3. Bước đầu đánh giá một số ảnh hưởng của tinh dầu Bạch đàn đến môi trường sinh thái.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp thu thập và kế thừa tài liệu

Các tài liệu liên quan đến vấn đề nghiên cứu ở trong và ngoài nước được thu thập, chọn lọc và sử dụng để phân tích, đánh giá thực trạng trồng rừng Bạch đàn ở nước ta. Các nghiên cứu về thành phần và đặc tính tinh dầu Bạch đàn trên thế giới cũng được nghiên cứu sử dụng để so sánh, đánh giá cùng với kết quả nghiên cứu của đề tài. Trong nghiên cứu còn tham khảo các phương pháp phân tích tinh dầu bằng phương pháp phân tích Sắc ký khí và Sắc ký khí ghép nối khối phổ.

2.4.2. Phương pháp điều tra, lấy mẫu ngoài thực địa

Căn cứ vào tài liệu thu thập được nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát tại hai địa phương có trồng các loài Bạch đàn đó là thị trấn Xuân Mai, huyện Chương Mỹ thành phố Hà Nội và tại xã Trường Sơn, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang. Từ đó chọn ra các loài Bạch đàn đặc trưng để lấy mẫu về phòng thí nghiệm tách chiết tinh dầu và phân tích thành phần hóa học của nó. Trước khi lấy mẫu cần tiến hành khảo sát toàn bộ khu vực trồng rừng Bạch đàn. Công việc khảo sát bao gồm quan sát đánh giá một cách định tính sự đa dạng thành phần các loài cây dưới tán.

Tại rừng thực nghiệm của trường Đại học Lâm nghiệp, loài Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) 20 năm tuổi và loài Bạch đàn xanh (Eucalyptus globulus) 20 năm tuổi đã được lựa chọn để lấy mẫu nghiên cứu, Hình 2.

Hình 2. Lấy mẫu lá tại rừng thực nghiệm tại Xuân Mai, Hà Nội

Tại xã Trường Sơn, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang loài Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora) đã được lựa chọn để lấy mẫu lá nghiên cứu.

Mẫu lá của mỗi loài được lấy trên cùng một cây nhưng lấy ở ba tầng khác nhau gồm tầng ngọn, tầng giữa và tầng tán dưới. Mẫu lá ở mỗi tầng này có số lượng bằng nhau và được tách riêng biệt, đựng trong túi nilon, mã hóa và bảo quản ở nhiệt độ tử 2 - 40C. Thời điểm tiến hành lấy mẫu nghiên cứu trong tháng 8 năm 2010.

Ngoài mẫu lá đề tài còn tiến hành lấy thêm mẫu rễ của loài Bạch đàn trắng để nghiên cứu đánh giá tìm hiểu về sự có mặt của các chất hóa học tương ứng với tinh dầu mẫu lá của nó. Mẫu rễ được lấy trên cùng một cây lấy mẫu lá và cũng được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 40C trước khi phân tích.

2.4.3. Phương pháp tách chiết và phân tích tinh dầu

2.4.3.1. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

- Hoá chất

+ Diclometan, Merck (CHLB Đức);

+ Nước cất 2 lần;

+ Na2SO4 khan.

- Thiết bị, dụng cụ

+ Máy sắc ký khí Master GC sử dụng detectơ FID, Italya;

+ Máy sắc ký khí Hewlet Parkard 6890 sử dụng detector MS, Mỹ;

+ Xylanh bơm mẫu dung tích 10 µl, 20 µl;

+ Thiết bị chiết dòng ngưng liên tục;

+ Thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước;

+ Cân phân tích có sai số d = 0,1 mg;

+ Bếp ổn nhiệt, nhiệt độ max 3000 C;

+ Nhiệt kế có nhiệt độ tối đa 3000 C của Nga;

+ Micro pipet 20 μl; 100 μl; 1000 μl;

+ Đá bọt;

+ Lọ đựng mẫu 2 ml.

2.4.3.2. Tách chiết tinh dầu Bạch đàn

- Chuẩn bị dụng cụ

Dụng cụ dùng cho chuẩn bị mẫu xác định các chất ở lượng vết, máy sắc ký có độ nhạy cao 10-11- 10-12g nên để tránh nhiễu kết quả thì khâu chuẩn bị dụng cụ có ý nghĩa rất quan trọng. Tất cả các dụng cụ thủy tinh được làm sạch theo các bước sau:

+ Rửa sạch bằng xà phòng;

+ Tráng nhiều lần bằng nước thường;

+ Tráng 3 lần bằng nước cất 2 lần;

+ Tráng 3 lần bằng dung môi CH2Cl2;

+ Sấy toàn bộ dụng cụ trong tủ sấy ở nhiệt độ 2000C trong 2 giờ;

Tất cả các dụng cụ trước khi sử dụng phải được tráng lại nhiều lần bằng bằng dung môi CH2Cl2 hoặc n – hexan.

- Chuẩn bị mẫu phân tích

Mẫu lá dùng để phân tích là mẫu tổ hợp của ba loại mẫu lấy ở tầng ngọn, tầng giữa và tầng tán trộn lại với nhau theo cùng một tỷ lệ. Trước khi phân tích mẫu lá và rễ được rửa bằng nước lạnh rồi được bảo quản trong tủ lạnh sâu có nhiệt độ -180C.

- Tách tinh dầu

Đề tài sử dụng hai phương pháp cất lôi cuốn hơi nước và chiết dòng ngưng liên tục để tách chiết tinh dầu trong mẫu nghiên cứu.

+ Phương pháp cất lôi cuốn hơi nước

Phương pháp này cho phép chiết khá triệt để các chất có mặt trong các bộ phận của cây. Phương pháp cất lôi cuốn hơi nước tốn ít thời gian, không gây độc đối với môi trường.

Hệ thống cất lôi cuốn hơi nước (Hình 3) gồm hai bình nối tiếp nhau, bình trên đựng mẫu cần chiết, bình dưới đựng nước. Khi đun sôi nước ở nhiệt độ 2000C sẽ tạo ra một luồng hơi nước nóng có áp suất cao sục qua mẫu lá làm cuốn đi các thể tinh dầu đến ống sinh hàn. Tại đây hơi nước và tinh dầu được làm lạnh rồi ngưng tụ vào phần thu mẫu tinh dầu. Quá trình phân lớp xảy ra tại đây. Tinh dầu có tỉ khối nhẹ hơn nước nên nổi lên phía trên còn nước chìm xuống phía dưới. Tách nước ta sẽ thu được phần tinh dầu của mẫu nghiên cứu.

Hình 3. Thiết bị cất lôi cuốn hơi nước

Trong suốt quá trình cất tinh dầu nhiệt độ của bếp đun được giữ ổn định ở 2000C, hơi nước đo được có nhiệt độ 980C. Đề tài tiến hành cất lôi cuốn trong các khoảng thời gian khác nhau cho các mẫu khác nhau để đánh giá sự biến đổi thành phần hóa học trong tinh dầu theo thời gian cất, xác định tỉ khối và hàm lượng phần trăm của tinh dầu trong mẫu nghiên cứu. Khối lượng mẫu lá (lá tươi) cho một lần cất hơi nước là 200 g. Thời gian tiến hành cất lôi cuốn hơi nước cho mỗi loại mẫu (mẫu lá Bạch đàn trắng và mẫu lá Bạch đàn xanh) thực hiện trong 5 khoảng thời gian khác nhau, đó là: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ và 4 giờ và 5 giờ kể từ lúc nước sôi.

+ Phương pháp cất dòng ngưng liên tục

Hệ thống cất dòng ngưng liên tục được bố trí như hình 4.

Hình 4. Thiết bị cất dòng ngưng liên tục

Hệ thống cất dòng ngưng gồm 2 bình cầu đặt song song cùng nối vào ống sinh hàn. Mẫu lá tổ hợp được cắt nhỏ có kích thước 1x3 cm, cân lấy 5 gam mẫu cho vào bình cầu đựng mẫu (bình 1) và mẫu được ngâm trong nước cất 2 lần đến khoảng 3/5 bình, bình cầu còn lại (bình 2) cho vào 7 ml dung môi điclometan. Cả hai bình cầu này được nối với cùng một ống sinh hàn. Khi đung nóng bình cầu với nhiệt độ của bếp là 1000C làm sôi nước trong bình cầu, bình cầu đựng điclometan được cấp nhiệt ở 600C. Hơi nước trong bình cầu đựng mẫu sẽ bay lên cuốn theo cả các phân tử tinh dầu cùng với dung môi điclometan cũng được bay lên và gặp nhau ở bề mặt sinh hàn. Tại đây quá trình chiết bắt đầu xảy ra, tinh dầu sẽ tự động hòa tan vào dung môi điclometan và tách ra khỏi nước. Cả tinh dầu, điclometan và nước được làm lạnh và ngưng lại phần thu. Điclometan nặng hơn nước lên chìm xuống dưới còn nước nổi lên trên. Phần nước sẽ quay ngược lại bình cầu đựng mẫu còn phần điclometan chứa tinh dầu sẽ quay lại bình cầu đựng đựng điclometan. Quá trình cứ thế diễn ra trong một khoảng thời gian nhất định tùy thuộc vào từng nghiên cứu. Mỗi một loài Bạch đàn cũng tiến hành nghiên cứu cất nhiều mẫu của cùng một loài trong các khoảng thời gian khác nhau như phương pháp lôi cuốn hơi nước để khảo sát đánh giá khả năng tách chiết của phương pháp theo thời gian.

Đối với mẫu rễ của loài Bạch đàn trắng đề tài lựa chọn phương pháp cất dòng ngưng liên tục để nghiên cứu. Khối lượng của mẫu rễ trong mỗi lần chiết là 10 gam, tiến hành chiết liên tục 3 mẫu rồi gộp toàn bộ 3 phần dung thu được thành một mẫu, đem đi làm giầu xuống còn 1,0 ml. Mẫu này được dùng để phân tích trên GC/FID và GC/MS. Tất cả các mẫu thu được trước khi phân tích trên các hệ thống máy sắc ký đều được cho chạy qua cột Na2SO4 khan đã được sấy khô để loại nước.

2.4.3.4. Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu Bạch đàn

- Phương pháp phân tích bằng kỹ thuật GC/FID

Đây là phương pháp phân tích hiện đại được ứng dụng rộng rãi để xác định các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi, bền nhiệt. Mẫu tinh dầu sau khi tách chiết được hòa tan vào trong dung môi n-hecxan để bơm vào hệ thống sắc ký GC-Master của Italia tại trường Đại học Lâm nghiệp. Phương pháp này sẽ phát hiện được số các hợp chất có trong tinh dầu ở mức hàm lượng rất nhỏ cỡ ppm đến ppb đồng thời sử dụng để khảo sát các chương trình phân tích mẫu trước khi phân tích trên hệ thống GC/MS

Chương trình làm việc của hệ thống sắc ký như sau:

+ Cột mao quản DN 17, nhiệt độ cao nhất 3500C, kích thước cột: 30m x 320µm x 0,25 µm (chiều dài x đường kính trong x bề dầy lớp hấp phụ);

+ Chương trình nhiệt độ của cột tách: nhiệt độ ban đầu 600C giữ trong 1 phút, nâng lên đến 900C với tốc độ gia nhiệt 30C/phút, nâng tiếp lên 1200C với tốc độ gia nhiệt 150C/phút, nâng tiếp lên 2000C với tốc độ gia nhiệt 50C/phút, giữ trong 10 phút;

+ Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 2500C

+ Nhiệt độ của detectơ: 2500C

+ Khí mang: N2 (99,9999%)

+ Tốc độ dòng khí mang: 1,3 ml/phút

+ Chế độ bơm mẫu chia dòng 1:24

+ Thể tích bơm mẫu: 1 µl

- Phương pháp sắc ký khí với detertơ khối phổ

Đây là phương pháp phân tích hiện đại hiện nay trong việc xác định các hợp chất hóa học hữu cơ. Các hợp chất hữu cơ khác nhau sau khi được tách ra khỏi nhau bằng kỹ thuật sắc ký sẽ được đưa vào hệ thống khối phổ để xác định khối lượng các mảnh ion được bắn phá trong hệ thống ion hóa, trên cơ sở đó có thể xác định được tên và công thức cấu tạo của chất. Thư viện phổ sẽ giúp xác định công thức cấu tạo của hợp chất cần nghiên cứu.

Chương trình làm việc của hệ thống sắc ký khí khối phổ như sau:

+ Cột mao quản BD-5, 19091z - 413, nhiệt độ cao nhất 3550C , kích thước: chiều dài, đường kính trong, bề dầy lớp hấp phụ tương ứng là 30 m, 320 µm, 0,25 µm;

+ Chương trình nhiệt độ cột tách: : nhiệt độ ban đầu 600C giữ trong 1 phút, nâng lên đến 900C với tốc độ gia nhiệt 30C/phút, nâng tiếp lên 1200C với tốc độ gia nhiệt 150C/phút, nâng tiếp lên 2000C với tốc độ gia nhiệt 50C/phút, giữ trong 10 phút;

+ Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 2500C;

+ Chế độ bơm mẫu chia dòng 1:24;

+ Thể tích bơm mẫu: 1 µl;

+ Sử dụng chế độ đo chọn lọc ion;

+ Ion hóa chất theo nguyên tắc va đập điện tử.

2.4.4. Phương pháp tin sinh học dự đoán hoạt tính sinh học của chất

Việc sử dụng phần mềm Phổ dự đoán hoạt tính sinh học của chất - PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) dựa trên quan điểm cho rằng hoạt tính là hàm của cấu trúc phân tử của chất (Activity = f(Structure). Do vậy việc so sánh cấu trúc của một hợp chất cần nghiên cứu với cấu trúc của các chất có hoạt tính sinh học đã biết thì hoạt tính sinh học của chất cần nghiên cứu có thể xác định được.

Trong cơ sở dữ liệu của PASS bao gồm khoảng 46000 hợp chất có hoạt tính sinh học, trong đó khoảng 16000 chất đã được sử dụng làm thuốc, 30000 chất đang được đề nghị cho kiểm tra lâm sàng hoặc tiền lâm sàng.

Hình 2.4. Sơ đồ quá trình phát triển của PASS

Chương trình tính toán PASS có thể dự đoán đồng thời 400 loại hoạt tính cùng một lúc với độ chính xác đạt 85% bằng cách dựa trên công thức cấu tạo của hợp chất. Trong cơ sở dữ liệu của PASS chứa tới 6825 loại hoạt tính sinh học bao gồm các hiệu ứng dược lý, cơ chế hóa sinh của các tác động, các độc tính cụ thể. Một vài hoạt tính có mặt trong cơ sở dữ liệu của PASS chỉ có ở một hoặc hai hợp chất và những hoạt tính này không nằm trong phổ dự đoán của PASS. Sau khi đưa thông tin về cấu trúc phân tử của hợp chất nghiên cứu hoạt tính sinh học vào chương trình tính toán của PASS, phần mềm tính sẽ so sánh cấu trúc của phân tử này với cấu trúc của các chất có trong cơ sở dữ liệu với các hoạt tính sinh học đã được mô tả để từ đó sẽ tự động tính toán đưa ra xác suất xuất hiện các hoạt tính sinh học khác nhau của chất nghiên cứu trên cơ sở phương pháp xác suất Bayesian. Sai số dự đoán cực đại (MEP - maximal error of prediction) được tính toán qua tất cả các chất có trong cơ sở dữ liệu với các hoạt tính của nó. MEP trung bình cỡ 0,137 và như vậy độ chính xác trung bình của dự đoán cỡ 0,863. Độ chính xác như vậy là đủ đảm bảo yêu cầu sử dụng chương trình tính toán PASS. Kết quả của phép dự đoán PASS còn tính ra xác suất có mặt (Pa) và xác suất không có mặt (Pi) một tính chất nào đó của chất, đồng thời còn chỉ ra cả số các chất có tính chất đó. Độ tin cậy của dự đoán khi Pa > 0,7 đồng thời số các chất có hoạt tính đó > 5 chất.

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thời gian chiết tối ưu và khối lượng tinh dầu trong mẫu nghiên cứu

Sử dụng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước để xác định khối lượng (tính trên mẫu lá tươi) và tỉ khối của tinh dầu các loài Bạch đàn nghiên cứu.

Đối với mỗi loài Bạch đàn đề tài đã khảo sát hiệu quả của phương pháp cất lôi cuốn hơi nước theo thời gian. Kết quả nghiên cứu được nêu trong các Bảng 5, Bảng 6 và Bảng 7.

Đối với loài Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) trồng tại Xuân Mai, huyện Chương Mỹ, thành phố Hà Nội được thu hái vào ngày 2 tháng 8 năm 2010, kết quả nghiên cứu được mô tả trong Bảng 5.

Bảng 5. Khối lượng và thể tích tinh dầu trong lá Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước theo thời gian

Mẫu	Khối lượng mẫu lá (gam)	Thời gian chiết (giờ)	Khối lượng tinh dầu (gam)	Thể tích tinh dầu (ml)	Phần trăm khối lượng tinh dầu trên lá tươi (%)	Tỉ khối (g/ml)
EC-LC01	200	1	0,7826	0,95	0,3913	0,8238
EC-LC02	200	2	0,8240	0,96	0,4120	0,8583
EC-LC03	200	3	1,0020	1,17	0,5010	0,8546
EC-LC04	200	4	1,0632	1,24	0,5316	0,8610
EC-LC05	200	5	1,0630	1,24	0,5315	0,8609

Qua bảng số liệu trên nhận thấy với thời gian chiết là 4 giờ thì tỷ lệ % về khối lượng của tinh dầu trên khối lượng lá tươi đạt giá trị cực đạt là 0,5316%, tỉ khối của tinh dầu đạt cực đại ở thời gian này, điều đó chứng tỏ rằng những cấu tử nhẹ sẽ được lôi cuốn đi trước mặc dù sự thay đổi này là không đáng kể.

Đối với loài Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora) trồng tại xã Trường Sơn, huyện Lục Lam, tỉnh Bắc Giang được thu hái vào ngày 10 tháng 8 năm 2010, kết quả nghiên cứu được mô tả trong Bảng 6.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

Page 2

1.2.4. Hoạt tính trừ cỏ của tinh dầu Bạch đàn

Theo Kohli và cộng sự (1998), Singh và cộng sự (2005), Batish và cộng sự (2007), Setia và cộng sự (2007) cho rằng tinh dầu của một số loài Bạch đàn có biểu hiện kháng lại các loài cỏ dại và có một tiềm năng tốt cho kiểm soát cỏ dại. Cũng theo Kohli (1998), tinh dầu của loài E. tereticornis và E. citriodora khi ở dạng hơi có khả năng làm giảm sự nảy mầm của cỏ hại Parthenium hysterophorus. Hơi tinh dầu Bạch đàn có khả năng làm giảm sự phát triển chlorophyll và hàm lượng nước, sự hô hấp của tế bào trong các loài thực vật trưởng thành. Hoạt tính ức chế đó phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc và hiện tượng suy giảm sự phát triển của cỏ dại quan sát được trong thời kỳ tiếp xúc với tinh dầu. Sau 14 ngày tiếp xúc với hơi tinh dầu, thực vật đã có những biểu hiện của sự tổn thương được quan sát như sự úa vàng và chết hoặc sự gây tổn hại đến mô. Tinh dầu của loài E. citriodora có tính độc hơn loài E. tereticornis và thuộc tính này do sự khác nhau về cấu tạo hóa học của các hợp chất trong tinh dầu. Nghiên cứu của Kohli và cộng sự đã kết luận rằng tinh dầu Bạch đàn đang hứa hẹn tốt cho công tác quản lý cỏ dại. Tuy nhiên các tác giả lại chưa định lượng được những độc tính của nó đối với các loài thực vật liên đới và các vi sinh vật. Theo Batish và cộng sự (2004) cho rằng việc xác định tác động của tinh dầu Bạch đàn tách chiết từ Bạch đàn chanh đối với một số loài cây trồng như Triticum aestivum, Zea mays, Raphanus sativus và các loài cỏ dại như Cassia occidentalis, Amaranthus viridis và Echinochloa crus-galli. Cũng theo nhóm tác giả đã chứng minh tinh dầu đã bộc lộ những độc tính rất rõ ràng đối với một số loài và ảnh hưởng của tính độc đó rõ hơn đối với sự nảy mầm của các loài cây nhỏ như A. viridis [6].

1.3. Tình hình nghiên cứu về tinh dầu Bạch đàn ở Việt Nam

Hiện nay ở nước ta cây Bạch đàn vẫn là loài cây được trồng chủ yếu để phủ xanh đất trống đồi núi trọc và để cung cấp nguồn nguyên liệu cho công nghiệp giấy và xây dựng, cho nên việc nghiên cứu về loài cây này phần lớn tập trung vào quá trình trồng và chăm sóc. Tuy nhiên bên cạnh giá trị về cung cấp gỗ thì tinh dầu trong lá của chúng còn có một số tính chất rất quý, đặc biệt là loài Bạch đàn chanh là loài có tinh dầu đáng quan tâm nhất trong chi Bạch đàn ở nước ta. Tinh dầu của nó cũng đã được một số tác giả quan tâm và nghiên cứu. Theo Lã Đình Mỡi, Bạch đàn không chỉ là loài cây cung cấp gỗ cho công nghiệp giấy sợi mà còn là nguồn nguyên liệu lấy tinh dầu cho công nghiệp dược phẩm, hoá mỹ phẩm và công nghiệp chế biến thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ thực vật. Do đó Bạch đàn đã và đang là những đối tượng được quan tâm nghiên cứu để trồng rừng tại nhiều khu vực khác nhau trên thế giới [4]. Đỗ Tất Lợi đã mô tả lá Bạch đàn được dùng để chữa ho, giúp tiêu hóa, ngoài ra còn dùng để chữa cảm sốt [2].

Trong các công trình nghiên cứu về tinh dầu của loài cây này phải kể đến công trình nghiên cứu của Nguyễy Xuân Dũng và cộng sự (1995). Tác giả đã xác định được khoảng 30 hợp chất trong tổng số khoảng 40 hợp chất có trong tinh dầu Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora), hàm lượng tinh dầu trong lá tươi từ 1,8 - 2,0 %, tỉ trọng 0,87235, tỉ số chiết quang nD20 là 1,45852. Hàm lượng các chất trong tinh dầu như sau: citronellal (72,53 %), isopulegol (12,5 %), citronellol (5,61 %), neo- isopulegon (1,63 %), caryophyllen (1,16 %), 1,8-cineole (0,63 %) [3]. Tuy nhiên tác giả cũng chưa mô tả rõ phương pháp tách chiết và đặc biệt là độ tuổi của cây được chọn lấy mẫu lá nghiên cứu cũng như loại lá nghiên cứu (lá non, lá già hay lá bánh tẻ). Trong khi đó các nghiên cứu về thành phần hoá học trong tinh dầu của loài Bạch đàn này ở Australia có tỉ lệ các hợp chất so với nghiên cứu của Nguyễn Xuân Dũng có sự khác nhau đáng kể. Đặc biệt trong tất cả các nghiên cứu này các tác giả cũng chưa đánh giá đặc tính của các chất vừa xác định được.

Theo Nguyễn Thị Thái Hằng (1995) thì tinh dầu Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) chứa tới 64,79 % hoạt chất 1.8-cineole trong khi đó hợp chất này theo nghiên cứu của Nguyễn Xuân Dũng chỉ ở dạng vết trong tinh dầu lá Bạch đàn chanh. Đối với Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta), tác giả Nguyễn Thị Thái Hằng cho rằng hợp chất này chiếm tới 40 % – 82 % tinh dầu trong khi đó theo E. Guenther IV, 1950 thì chỉ có 29 %. Nguyễn Thị Thái Hằng cũng dẫn ra các hợp chất hóa học trong tinh dầu Bạch đàn trắng và Bạch đàn liễu, tuy nhiên cũng như các tác giả khác trên thế giới, ở đây tác giả cũng chưa đề cập đến đặc điểm của mẫu lá được nghiên cứu như về loại lá, tuổi của cây, vị trí địa lý trồng cây và đặc biệt là phương pháp chưng cất, tách chiết tinh dầu cũng như phương pháp phân tích. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thái Hằng thì Bạch đàn liễu lá có 0,4 % - 2,0 % tinh dầu, trong đó hợp chất chính là 1,8- cineole chiếm từ 40 % - 82 %.

Theo Lã Đình Mỡi, chất Citronella được coi là thành phần chủ yếu trong tinh dầu Bạch đàn chanh. Song Bạch đàn chanh không chỉ đa dạng về hình thái mà còn đa dạng về hoạt động sinh tổng hợp và tích lũy tinh dầu. Hàm lượng citronellal biến động rất rộng (từ 1 % đến 91 %). Căn cứ vào thành phần hóa học chính trong tinh dầu người ta cho rằng ở Australia loài Bạch đàn chanh có thể gồm bốn dạng hóa học:

Dạng Bạch đàn chanh trong tinh dầu chứa chủ yếu là citronellal (65 - 91 %): loại citronellal;
Dạng Bạch đàn chanh có các thành phần chính trong tinh dầu gồm citronellol (khoảng 50 %) và citronellal (1 – 14 %): loại citronellol và citronellal;
Dạng Bạch đàn chanh mà thành phần chính trong tinh dầu chỉ gồm citronellal (20 – 50 %) và guaiol: loại citronellal và guaiol;
Dạng Bạch đàn chanh với các hydrocacbon là thành phần chủ yếu của tinh dầu: loại hydrocacbon.

Đối với loài Bạch đàn trắng, theo Lã Đình Mỡi hàm lượng tinh dầu trong lá tương đối thấp, chỉ từ 0,14 – 0,28 % và các thành phần chính trong tinh dầu là ß-cymen, phellandren, cuminal, phellandral, geraniol và cineol.

Như vậy các nghiên cứu về tinh dầu Bạch đàn ở nước ta cho thấy nó có một số tính chất quý, có thể dùng làm thuốc. Thành phầnh hóa học rất đa dạng và phức tạp, đặc biệt có sự khác nhau giữa các loài, tuổi của cây và vị trí địa lý trồng cây. Tuy nhiên trong các nghiên cứu trên chưa thấy các tác giả mô tả phương pháp chưng cất và tách chiết trong khi đó yếu tố này ảnh hưởng rất lớn đến thành phần và hàm lượng các chất hóa học trong tinh dầu của lá. Trong các loài Bạch đàn mà các tác giả lựa chọn nghiên cứu cũng chưa chỉ rõ được lấy từ các địa phương nào của nước ta.

Một trong những vấn đề mà trong hầu tất cả những nghiên cứu của các tác giả đã dẫn ra ở trên chưa đề cập đến đó là việc nghiên cứu và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất chính trong tinh dầu. Khi đã dự đoán được hoạt tính sinh học của các chất chính có mặt trong tinh dầu thì nó sẽ tạo ra một cơ sở khoa học hết sức quan trọng để lựa chọn ra những tính chất cần thiết tạo thành các sản phẩm thương mại sau khi đã nghiên cứu thử nghiệm trên các loài động thực vật. Đồng thời nó sẽ đóng góp vào cơ sở khoa học để giải thích các tác động đến môi trường sinh thái của rừng trồng Bạch đàn ở nước ta và trên thế giới.

1.4. Các phương pháp nghiên cứu chưng cất và phân tích tinh dầu

1.4.1. Các phương pháp chưng cất tinh dầu

1.4.1.1. Phương pháp tẩm trích

Phương pháp tẩm trích bằng dung môi dễ bay hơi có nhiều ưu điểm vì tiến hành ở nhiệt độ phòng, nên thành phần hóa học của tinh dầu ít bị thay đổi. Phương pháp này không những được áp dụng để trích ly cô kết từ hoa mà còn dùng để tận trích khi các phương pháp khác không trích ly hết hoặc dùng để trích ly các loại nhựa dầu (oleoresin), gia vị.

- Nguyên tắc của phương pháp

Dựa trên hiện tượng thẩm thấu, khuếch tán và hòa tan của tinh dầu có trong các mô cây bằng các dung môi hữu cơ.

- Yêu cầu của dung môi

Yếu tố quan trọng nhất cho sự thành công của phương pháp này là đặc tính của dung môi sử dụng, do đó dung môi dùng trong tẩm trích cần phải đạt được những yêu cầu sau đây:

+ Hòa tan hoàn toàn và nhanh chóng các cấu phần có mùi thơm trong nguyên liệu;

+ Hòa tan kém các hợp chất khác như sáp, nhựa dầu có trong nguyên liệu;

+ Không có tác dụng hóa học với tinh dầu;

+ Không biến chất khi sử dụng lại nhiều lần;

+ Hoàn toàn tinh khiết, không có mùi lạ, không độc, không ăn mòn thiết bị, không tạo thành hỗn hợp nổ với không khí và có độ nhớt kém;

+ Nhiệt độ sôi thấp vì khi chưng cất dung dịch trích ly để thu hồi dung môi, nhiệt độ sôi cao sẽ ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu. Điểm sôi của dung môi nên thấp hơn điểm sôi của cấu phần dễ bay hơi nhất trong tinh dầu.

+ Ngoài ra, cần có thêm những yếu tố phụ khác như: giá thành thấp, nguồn cung cấp dễ tìm, …

Thường thì không có dung môi nào thỏa mãn tất cả những điều kiện kể trên. Người ta sử dụng cả dung môi không tan trong nước như dietyl ete, ete dầu hỏa, hexan, cloroform,… lẫn dung môi tan trong nước như etanol, aceton. Trong một số trường hợp người ta còn dùng một hỗn hợp dung môi.

- Quy trình tẩm trích

Phương pháp trích ly thích hợp cho các nguyên liệu có chứa lượng tinh dầu không lớn lắm hoặc có chứa những cấu phần tan được trong nước và không chịu được nhiệt độ quá cao. Quy trình kỹ thuật gồm các giai đoạn sau:

+ Tẩm trích: nguyên liệu được ngâm vào dung môi trong bình chứa. Trong một số trường hợp, để gia tăng khả năng trích ly, nguyên liệu cần được xay nhỏ trước. Hỗn hợp nguyên liệu và dung môi cần được xáo trộn đều trong suốt thời gian trích ly. Nên khảo sát trước xem việc gia nhiệt có cần thiết hay không, nếu cần, cũng không nên gia nhiệt quá 50oC để không ảnh hưởng đến mùi thơm của sản phẩm sau này.

+ Xử lý dung dịch ly trích: sau khi quá trình tẩm trích kết thúc, dung dịch ly trích được lấy ra và có thể thay thế bằng dung môi mới sau một khoảng thời gian nhất định, tùy theo nguyên liệu. Tách nước (nếu có) ra khỏi dung dịch, rồi làm khan bằng Na2SO4 và lọc. Dung môi phải được thu hồi ở nhiệt độ càng thấp càng tốt để tránh tình trạng sản phẩm bị mất mát và phân hủy. Do đó, nên loại dung môi ra khỏi sản phẩm bằng phương pháp cô quay chân không. Dung môi thu hồi có thể dùng để trích ly lần nguyên liệu kế tiếp.

+ Xử lý sản phẩm trích ly: sau khi thu hồi hoàn toàn dung môi, sản phẩm là một chất đặc sệt gồm có tinh dầu và một số hợp chất khác như nhựa, sáp, chất béo, cho nên cần phải tách riêng tinh dầu ra. Chất đặc sệt này đem đi chưng cất bằng hơi nước để tách riêng tinh dầu ra. Tinh dầu có mùi thơm tự nhiên, nhưng khối lượng thu được kém, ngoài ra tinh dầu này có chứa một số cấu phần thơm có nhiệt độ sôi cao nên có tính chất định hương rất tốt.

+ Tách dung dịch từ bã: sau khi tháo hết dung dịch trích ly ra khỏi hệ thống, trong bã còn chứa một lượng dung dịch rất lớn (khoảng 20 – 30% lượng dung môi trích ly). Phần dung dịch còn lại nằm trong nguyên liệu thường được lấy ra bằng phương pháp chưng cất hơi nước (trường hợp dung môi không tan trong nước), hoặc ly tâm, lọc ép (trường hợp dung môi tan trong nước). Sau đó dung dịch này cũng được tách nước, làm khan và nhập chung với dung dịch trích ly.

Chất lượng thành phẩm và hiệu quả của phương pháp trích ly này phụ thuộc chủ yếu vào dung môi dùng để trích ly. Để đạt kết quả tốt thì dung môi sử dụng phải thoả mãn được các yêu cầu đã được trình bày ở trên.

Vì dung môi dễ bay hơi nên chúng ta cần phải lưu ý đến tỉ lệ thất thoát dung môi trong quy trình trích ly vì việc này có thể ảnh hưởng rất lớn đến giá thành sản phẩm.

Trong điều kiện phòng thí nghiệm, khi muốn tiến hành phương pháp tẩm trích với dung môi dễ bay hơi thì tiến hành sử dụng phương pháp truyền thống như khuấy từ ở nhiệt độ phòng hoặc đun – khuấy từ (kèm ống hoàn lưu) hay phương pháp dùng Soxhlet. Ngoài ra, cùng với sự phát triển ngày càng mạnh mẽ của “hóa học xanh”, mà ngày nay, chúng ta còn áp dụng các phương pháp mới như là: tẩm trích có sự hỗ trợ của siêu âm và vi sóng.

- Ưu và nhược điểm

+ Ưu điểm: sản phẩm thu được theo phương pháp này thường có mùi thơm tự nhiên. Hiệu suất sản phẩm thu được thường cao hơn các phương pháp khác.

+ Khuyết điểm: yêu cầu cao về thiết bị; thất thoát dung môi; quy trình tương đối phức tạp và tốn kém chi phí.

1.4.1.2. Phương pháp chưng cất hơi nước

Phương pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian nhất định. Trường hợp mô thực vật có chứa sáp, nhựa, axít béo thì khi chưng cất phải được thực hiện trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuyếch tán trở nên khó khăn.

- Lý thuyết chưng cất

Chưng cất có thể được định nghĩa là: Sự tách rời các cấu phần của một hỗn hợp nhiều chất lỏng dựa trên sự khác biệt về áp suất hơi của chúng. Trong trường hợp đơn giản, khi chưng cất một hỗn hợp gồm 2 chất lỏng không hòa tan vào nhau, áp suất hơi tổng cộng của hỗn hợp là tổng của hai áp suất hơi riêng phần. Do đó, nhiệt độ sôi của hỗn hợp sẽ tương ứng với áp suất hơi tổng cộng xác định, không tùy thuộc vào thành phần phần trăm của hỗn hợp, miễn là lúc đó hai pha lỏng vẫn còn tồn tại. Nếu vẽ đường cong áp suất hơi của từng chất theo nhiệt độ, rồi vẽ đường cong áp suất hơi tổng cộng, thì ứng với một áp suất, ta dễ dàng suy ra nhiệt độ sôi tương ứng của hỗn hợp và nhận thấy là nhiệt độ sôi của hỗn hợp luôn luôn thấp hơn nhiệt độ sôi của từng hợp chất. Thí dụ, ở áp suất 760 mmHg nước sôi ở 100oC và benzen sôi ở 80oC và chúng là hai chất lỏng không tan vào nhau. Thực hành cho thấy, nếu đun hỗn hợp này dưới áp suất 760 mmHg nó sẽ sôi ở 69oC cho đến khi nào còn hỗn hợp hai pha lỏng hoà tan vào nhau với bất kì tỉ lệ nào. Giản đồ nhiệt độ sôi theo áp suất cho thấy, tại 69oC, áp suất hơi của nước là 225 mmHg và benzen là 535 mmHg. Chính vì đặc tính làm giảm nhiệt độ sôi này mà từ lâu phương pháp chưng cất hơi nước là phương pháp đầu tiên dùng để tách tinh dầu ra khỏi nguyên liệu thực vật.

- Những ảnh hưởng chính trong sự chưng cất hơi nước

+ Sự khuếch tán

Ngay khi nguyên liệu được làm vỡ vụn thì chỉ có một số mô chứa tinh dầu bị vỡ và cho tinh dầu thoát tự do ra ngoài theo hơi nước lôi cuốn đi. Phần lớn tinh dầu còn lại trong các mô thực vật sẽ tiến dần ra ngoài bề mặt nguyên liệu bằng sự hòa tan và thẩm thấu. Von Rechenberg đã mô tả quá trình chưng cất hơi nước như sau: “Ở nhiệt độ nước sôi, một phần tinh dầu hòa tan vào trong nước có sẵn trong tế bào thực vật. Dung dịch này sẽ thẩm thấu dần ra bề mặt nguyên liệu và bị hơi nước cuốn đi. Còn nước đi vào nguyên liệu theo chiều ngược lại và tinh dầu lại tiếp tục bị hòa tan vào lượng nước này. Quy trình này lặp đi lặp lại cho đến khi tinh dầu trong các mô thoát ra ngoài hết.

Như vậy, sự hiện diện của nước rất cần thiết, cho nên trong trường hợp chưng cất sử dụng hơi nước quá nhiệt cần tránh để nguyên liệu bị khô. Nhưng nếu lượng nước sử dụng thừa cũng không có lợi, nhất là trong trường hợp tinh dầu có chứa những cấu phần tan dễ trong nước.

Ngoài ra, vì nguyên liệu được làm vỡ vụn ra càng nhiều càng tốt, nên khi đó cần làm cho lớp nguyên liệu có một độ xốp nhất định để hơi nước có thể đi xuyên ngang lớp này đồng đều và dễ dàng.

+ Sự thủy phân

Những cấu phần este trong tinh dầu thường dễ bị thủy phân tạo ra axit và rượu khi đun nóng trong một thời gian dài với nước. Do đó, để hạn chế hiện tượng này, sự chưng cất hơi nước phải được thực hiện trong một thời gian càng ngắn càng tốt.

+ Nhiệt độ

Nhiệt độ cao làm phân hủy tinh dầu. Do đó, khi cần thiết phải dùng hơi nước quá nhiệt (trên 100oC) và thực hiện việc này trong giai đoạn cuối cùng của sự chưng cất sau khi các cấu phần dễ bay hơi đã lôi cuốn đi hết. Thực ra, hầu hết các tinh dầu đều kém bền dưới tác dụng của nhiệt nên vấn đề là làm sao cho thời gian chịu nhiệt độ cao của tinh dầu càng ngắn càng tốt.

Tóm lại, dù ba ảnh hưởng trên được xem xét độc lập nhưng thực tế thì chúng có liên quan với nhau và quy về ảnh hưởng của nhiệt độ. Khi tăng nhiệt độ, sự khuếch tán thẩm thấu sẽ tăng, sự hòa tan tinh dầu trong nước sẽ tăng nhưng sự phân hủy cũng tăng theo.

Trong công nghiệp người ta chia các phương pháp chưng cất hơi nước ra thành ba loại chính: chưng cất bằng nước, chưng cất bằng hơi nước và chưng cất bằng hơi nước.

Đối với trường hợp chưng cất bằng nước, trong trường hợp này nước phủ kín nguyên liệu nhưng phải chừa một khoảng không gian tương đối lớn phía bên trên lớp nước để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chất nạp qua hệ thống hoàn lưu. Nhiệt cung cấp có thể đun trực tiếp bằng củi lửa hoặc bằng hơi nước dẫn từ nồi hơi vào (sử dụng bình có hai lớp đáy). Trong trường hợp chất nạp quá mịn, lắng chặt xuống đáy nồi, lúc đó nồi phải trang bị những cánh khuấy trộn đều bên trong trong suốt thời gian chưng cất. Sự chưng cất này không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy phân. Những nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này. Những cấu tử có nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng lớn nước phủ đầy, khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những chất này. Thí dụ điển hình là mùi tinh dầu hoa hồng thu được từ phương pháp chưng cất hơi nước kém hơn sản phẩm tẩm trích vì eugenol và ancol phenetil nằm lại trong nước khá nhiều, vì thế người ta chỉ dùng phương pháp này khi không thể sử dụng các phương pháp khác.

- Ưu điểm

+ Quy trình kỹ thuật tương đối đơn giản;

+ Thiết bị gọn, dễ chế tạo;

+ Không đòi hỏi vật liệu phụ như các phương pháp tẩm trích, hấp thụ;

+ Thời gian tương đối nhanh.

- Nhược điểm

+ Không có lợi đối với những nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp;

+ Chất lượng tinh dầu có thể bị ảnh hưởng nếu trong tinh dầu có những cấu phần dễ bị phân hủy;

+ Không lấy được các loại nhựa và sáp có trong nguyên liệu (đó là những chất định hương thiên nhiên rất có giá trị);

+ Trong nước chưng luôn luôn có một lượng tinh dầu tương đối lớn nằm dưới hai dạng phân tán và hòa tan. Dạng phân tán thì có thể dùng phương pháp lắng hay ly tâm, còn dạng hòa tan thì phải chưng cất lại. Nếu trọng lượng riêng của tinh dầu và nước quá gần nhau thì có thể thêm NaCl để gia tăng tỉ trọng của nước làm tinh dầu tách ra dễ dàng;

+ Những tinh dầu có nhiệt độ sôi cao thường cho hiệu suất rất kém.

1.4.1.3. Các phương pháp mới trong chưng cất tinh dầu

- Vi sóng

+ Cơ sở của phương pháp

Một số phân tử, thí dụ như nước, phân chia điện tích trong phân tử một cách bất đối xứng. Như vậy các phân tử này là những lưỡng cực có tính định hướng trong chiều của điện trường. Dưới tác động của điện trường một chiều, các phân tử lưỡng cực có khuynh hướng sắp xếp theo chiều điện trường này. Nếu điện trường là một điện trường xoay chiều, sự định hướng của các lưỡng cực sẽ thay đổi theo chiều xoay đó. Cơ sở của hiện tượng phát nhiệt do vi sóng là sự tương tác giữa điện trường và các phân tử phân cực bên trong vật chất. Trong điện trường xoay chiều có tần số rất cao (2,45x109 Hz), điện trường này sẽ gây ra một xáo động ma sát rất lớn giữa các phân tử, đó chính là nguồn gốc sự nóng lên của vật chất.

Với một cơ cấu có sự bất đối xứng cao, phân tử nước có độ phân cực rất lớn, do đó nước là một chất rất lý tưởng dễ đun nóng bằng vi sóng. Ngoài ra, các nhóm định chức phân cực như: -OH, -COOH, -NH2 … trong các hợp chất hữu cơ cũng là những nhóm chịu sự tác động mạnh của trường điện từ.

Do đó, những hợp chất càng phân cực càng rất mau nóng dưới sự chiếu xạ của vi sóng. Việc này có liên quan đến hằng số điện môi của hợp chất đó. Tóm lại, sự đun nóng bởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh chóng.

+ Quá trình trích ly dưới sự hỗ trợ của vi sóng

Dưới tác dụng của vi sóng, nước trong các tế bào thực vật bị nóng lên, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa tinh dầu bị vỡ ra. Tinh dầu thoát ra bên ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ thống ngưng tụ (phương pháp chưng cất hơi nước) hoặc hòa tan vào dung môi hữu cơ đang bao phủ bên ngoài nguyên liệu (phương pháp tẩm trích).

Mức độ chịu ảnh hưởng vi sóng của các loại mô tinh dầu không giống nhau do kiến tạo của các loại mô khác nhau, ngay khi nguyên liệu được làm nhỏ. Kết quả này được phản ánh qua thời gian trích ly.

Trong sự chưng cất hơi nước, việc trích ly tinh dầu có thể thực hiện trong điều kiện có thêm nước hay không thêm nước vào nguyên liệu (trường hợp nguyên liệu chứa nhiều nước, đây là đặc điểm của phương pháp chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng). Ngoài ra, nước có thể thêm một lần hoặc thêm liên tục (trường hợp lượng nước thêm một lần không đủ lôi cuốn hết tinh dầu trong nguyên liệu) cho đến khi sự trích ly chấm dứt.

Ngoài việc nước bị tác dụng nhanh chóng, các cấu phần phân cực (hợp chất có chứa oxi) hiện diện trong tinh dầu cũng bị ảnh hưởng bởi vi sóng. Ngược lại các cấu phần hidrocarbon ít chịu ảnh hưởng của vi sóng (do chúng có độ phân cực kém) nên sự trích ly chúng tựa như trong sự chưng cất hơi nước bình thường nhưng với vận tốc nhanh hơn rất nhiều vì nước được đun nóng nhanh bởi vi sóng.

Trong phòng thí nghiệm, nhóm tác giả Nguyễn Văn Minh và cộng sự - Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu đã nghiên cứu, sữa chữa và cải tiến lò vi sóng gia dụng để cho lò này có thể sử dụng trong cả việc trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất hơi nước, và cho cả phương pháp tẩm trích ở áp suất thường.

Năm 1998, Luque de Castro và cộng sự đã đưa ra kiểu lò vi sóng tiêu điểm hỗ trợ cho sự trích ly bằng Soxhlet (FMASE – Focused Microwave Assisted Soxhlet Extraction). Hệ thống này giúp cho thời gian trích ly hợp chất thiên nhiên sử dụng Soxhlet giảm xuống đáng kể và khả năng bảo vệ những hợp chất dễ bị phân hủy tăng lên.

- Siêu âm

+ Nguyên tắc của phương pháp

Siêu âm là âm thanh có tần số nằm ngoài ngưỡng nghe của con người (16 Hz – 18 kHz), siêu âm được chia làm hai vùng:

Vùng có tần số cao (5–10 MHz), ứng dụng trong y học để chuẩn đoán bệnh.

Vùng có tần số thấp hơn (20 – 100 kHz), ứng dụng trong các ngành khác (kích hoạt phản ứng hóa học, hàn chất dẻo, tẩy rửa, cắt gọt, …) dựa trên khả năng cung cấp năng lượng của siêu âm.

Siêu âm cung cấp năng lượng thông qua hiện tượng tạo và vỡ “bọt” (khoảng cách liên phân tử). Trong môi trường chất lỏng, bọt có thể hình thành trong nửa chu kỳ đầu và vỡ trong nữa chu kỳ sau, giải phóng một năng lượng rất lớn. Năng lượng này có thể sử dụng tẩy rửa chất bẩn ngay trong những vị trí không thể tẩy rửa bằng phương pháp thông thường, khoan cắt những chi tiết tinh vi, hoạt hóa nhiều loại phản ứng hóa học, làm chảy và hòa tan lẫn vào nhau trong việc chế tạo những sản phẩm bằng nhựa nhiệt dẻo, …

Hiện tượng tạo bọt và vỡ bọt: Trong lĩnh vực hợp chất thiên nhiên, siêu âm chủ yếu sử dụng để hỗ trợ cho phương pháp tẩm trích giúp thu ngắn thời gian trích ly. Trong một số trường hợp, phương pháp siêu âm cho hiệu suất cao hơn phương pháp khuấy từ.

1.4.2. Các phương pháp phân tích tinh dầu

Các phương pháp phân tích tinh dầu nói chung và tinh dầu Bạch đàn nói riêng được sử dụng là phương pháp phân tích Sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa (GC-FID) và Sắc ký khí với detectơ khối phổ (GC-MS)

1.4.2.1. Phương pháp phân tích Sắc ký khí với detectơ ion hoá ngọn lửa

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký dựa vào sự phân chia khác nhau của các chất vào hai pha luôn tiếp xúc với nhau và hai pha đó không hoà lẫn với nhau. Một pha là pha tĩnh, một pha là pha động.

Bản chất của phương pháp sắc ký chính là sự tách chất. Các chất được tách ra khỏi nhau dựa vào sự tương tác của chất giữa pha động và pha tĩnh. Pha động mang các chất đi dọc hệ thống sắc ký (là cột hoặc bản phẳng) có được phủ pha tĩnh đều khắp. Các chất trong mẫu khi đó sẽ chịu sự tương tác (phân bố) lặp lại giữa pha động và pha tĩnh dẫn đến kết quả chúng bị tách dần thành những dải trong pha động và vào lúc cuối của quá trình sắc ký các cấu tử sẽ bị tách biệt hẳn ra theo trật tự tăng dần tương tác với pha tĩnh. Cấu tử nào tương tác yếu với pha tĩnh sẽ theo pha động ra khỏi pha tĩnh trước, cấu tử nào tương tác mạnh với pha tĩnh sẽ ra sau. Các cấu tử khi ra khỏi pha tĩnh sẽ được ghi lại dưới dạng các đỉnh (pic) tách riêng rẽ và được in trên giấy gọi là sắc ký đồ.

Đối với phương pháp sắc ký khí pha động ở đây là chất khí (còn gọi là khí mang), pha tĩnh là chất rắn được nhồi vào phần trong của cột tách (đối với cột nhồi) hoặc là chất rắn hay chất lỏng được tẩm lên thành trong của cột tách (đối với cột mao quản hở). Ngày nay sắc ký khí đã trở thành một phương pháp phân tích công cụ quan trọng nhất để tách và phát hiện các chất trong thành phần của hỗn hợp phức tạp. Năm 1952 máy sắc ký khí đầu tiên được ra đời dưới sự chủ trì của giáo sư Keulemann và các cộng tác viên. Từ đó kỹ thuật sắc ký khí được hoàn chỉnh và phát triển rất mạnh, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học: hóa học, sinh học, y học, dược học, khoa học hình sự và đặc biệt trong nghiên cứu môi trường, thực phẩm,...

- Sơ đồ khối của máy Sắc ký khí

Hình 1. Sơ đồ khối của máy sắc ký khí

- Cơ chế phát hiện các chất của detectơ FID

Ngọn lửa trong detectơ được tạo ra bởi hỗn hợp của khí hyđrô và oxy. Khi chưa có chất phân tích đi vào detectơ thì thành phần trong ngọn lửa của detectơ chỉ có hyđrô, oxy và khí mang. Khi đó ngọn lửa tạo ra rất ít các electron. Dưới tác dụng của một điện trường các electron này được chuyển động về các điện cực trái dấu và sinh ra một dòng điện có cường độ rất nhỏ khoảng 10-12A gọi là dòng điện nền.

Khi có chất phân tích đi vào detectơ (các hydrocacbon) chúng sẽ bị năng lượng nhiệt của ngọn lửa bẻ gẫy mạch tạo thành các nhóm CH*, các nhóm CH* này sẽ bị oxy hóa bởi oxy có trong ngọn lửa tạo thành các gốc CHO+ và e-. Khi đó cường độ dòng điện sẽ tăng đột biến và chúng được khuếch đại, ghi lại dưới dạng các đỉnh pic. Mỗi pic đó là một chất.

Ví dụ cơ chế phát hiện benzen khi phân tích của detector FID như sau:

C6H6 → 6CH*

6CH* + 3O2 → 6CHO+ + 6e-

Khi đó số lượng các điện tử tăng lên đột biến làm cường độ dòng điện nền tăng lên đột biến và được ghi lại dưới dạng đỉnh pic ứng với một thời gian lưu nhất định.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

Page 3

1.4.2.2. Phương pháp phân tích Sắc ký khí với detecơ khối phổ

ABC + e → ABC+* + 2e (1)

ABC + e → ABC+2 + 3e (2)

Loại ion (1) được gọi là ion gốc hay ion phân tử.

ABC+* → A+ + BC*

ABC+* → AB+ + C*

AB+ → A+ + B

1.5. Phương pháp đánh giá hoạt chất sinh học của chất

Bảng 4. Hoạt tính sinh học của Fluorouracil [15]

STT	Hoạt tính	Năm tìm ra
	Chống ung thư	1962
	Độc phôi	1966
	Kháng vi rút	1971
	Ức chế tổng hợp Thimidine Tiriphosphate	1971
	Ức chế chuyển hóa RNA	1980
	Ức chế tổng hợp protein	1987
	Điều chỉnh chất chuyển hóa Lipit	1990
	Ức chế miễn dịch	1990
	Ức chế chất chuyển hóa	1991
	Kháng vi rút	1996

MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là:

- Đánh giá được đặc tính thành phần hóa học tinh dầu trong lá một số loài Bạch đàn trồng ở Miền Bắc Việt Nam;

- Bước đầu xác định, đánh giá mối liên hệ của thành phần chất trong tinh dầu Bạch đàn với một số vấn đề sinh thái môi trường.

2.2. Đối tượng và giới hạn nghiên cứu

2.3. Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được các mục tiêu trên đề tài tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

1. Khảo sát các phương pháp tách chiết tinh dầu từ lá Bạch đàn;

2. Xác định và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chất chính có trong tinh dầu các loài Bạch đàn nghiên cứu;

3. Bước đầu đánh giá một số ảnh hưởng của tinh dầu Bạch đàn đến môi trường sinh thái.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp thu thập và kế thừa tài liệu

2.4.2. Phương pháp điều tra, lấy mẫu ngoài thực địa

Hình 2. Lấy mẫu lá tại rừng thực nghiệm tại Xuân Mai, Hà Nội

Tại xã Trường Sơn, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang loài Bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora) đã được lựa chọn để lấy mẫu lá nghiên cứu.

2.4.3. Phương pháp tách chiết và phân tích tinh dầu

2.4.3.1. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

- Hoá chất

+ Diclometan, Merck (CHLB Đức);

+ Nước cất 2 lần;

+ Na2SO4 khan.

- Thiết bị, dụng cụ

+ Máy sắc ký khí Master GC sử dụng detectơ FID, Italya;

+ Máy sắc ký khí Hewlet Parkard 6890 sử dụng detector MS, Mỹ;

+ Xylanh bơm mẫu dung tích 10 µl, 20 µl;

+ Thiết bị chiết dòng ngưng liên tục;

+ Thiết bị chưng cất lôi cuốn hơi nước;

+ Cân phân tích có sai số d = 0,1 mg;

+ Bếp ổn nhiệt, nhiệt độ max 3000 C;

+ Nhiệt kế có nhiệt độ tối đa 3000 C của Nga;

+ Micro pipet 20 μl; 100 μl; 1000 μl;

+ Đá bọt;

+ Lọ đựng mẫu 2 ml.

2.4.3.2. Tách chiết tinh dầu Bạch đàn

- Chuẩn bị dụng cụ

+ Rửa sạch bằng xà phòng;

+ Tráng nhiều lần bằng nước thường;

+ Tráng 3 lần bằng nước cất 2 lần;

+ Tráng 3 lần bằng dung môi CH2Cl2;

+ Sấy toàn bộ dụng cụ trong tủ sấy ở nhiệt độ 2000C trong 2 giờ;

Tất cả các dụng cụ trước khi sử dụng phải được tráng lại nhiều lần bằng bằng dung môi CH2Cl2 hoặc n – hexan.

- Chuẩn bị mẫu phân tích

- Tách tinh dầu

Đề tài sử dụng hai phương pháp cất lôi cuốn hơi nước và chiết dòng ngưng liên tục để tách chiết tinh dầu trong mẫu nghiên cứu.

+ Phương pháp cất lôi cuốn hơi nước

Hình 3. Thiết bị cất lôi cuốn hơi nước

+ Phương pháp cất dòng ngưng liên tục

Hệ thống cất dòng ngưng liên tục được bố trí như hình 4.

Hình 4. Thiết bị cất dòng ngưng liên tục

2.4.3.4. Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu Bạch đàn

- Phương pháp phân tích bằng kỹ thuật GC/FID

Chương trình làm việc của hệ thống sắc ký như sau:

+ Cột mao quản DN 17, nhiệt độ cao nhất 3500C, kích thước cột: 30m x 320µm x 0,25 µm (chiều dài x đường kính trong x bề dầy lớp hấp phụ);

+ Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 2500C

+ Nhiệt độ của detectơ: 2500C

+ Khí mang: N2 (99,9999%)

+ Tốc độ dòng khí mang: 1,3 ml/phút

+ Chế độ bơm mẫu chia dòng 1:24

+ Thể tích bơm mẫu: 1 µl

- Phương pháp sắc ký khí với detertơ khối phổ

Chương trình làm việc của hệ thống sắc ký khí khối phổ như sau:

+ Cột mao quản BD-5, 19091z - 413, nhiệt độ cao nhất 3550C , kích thước: chiều dài, đường kính trong, bề dầy lớp hấp phụ tương ứng là 30 m, 320 µm, 0,25 µm;

+ Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 2500C;

+ Chế độ bơm mẫu chia dòng 1:24;

+ Thể tích bơm mẫu: 1 µl;

+ Sử dụng chế độ đo chọn lọc ion;

+ Ion hóa chất theo nguyên tắc va đập điện tử.

2.4.4. Phương pháp tin sinh học dự đoán hoạt tính sinh học của chất

Hình 2.4. Sơ đồ quá trình phát triển của PASS

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thời gian chiết tối ưu và khối lượng tinh dầu trong mẫu nghiên cứu

Sử dụng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước để xác định khối lượng (tính trên mẫu lá tươi) và tỉ khối của tinh dầu các loài Bạch đàn nghiên cứu.

Bảng 5. Khối lượng và thể tích tinh dầu trong lá Bạch đàn trắng thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước theo thời gian

Mẫu	Khối lượng mẫu lá (gam)	Thời gian chiết (giờ)	Khối lượng tinh dầu (gam)	Thể tích tinh dầu (ml)	Phần trăm khối lượng tinh dầu trên lá tươi (%)	Tỉ khối (g/ml)
EC-LC01	200	1	0,7826	0,95	0,3913	0,8238
EC-LC02	200	2	0,8240	0,96	0,4120	0,8583
EC-LC03	200	3	1,0020	1,17	0,5010	0,8546
EC-LC04	200	4	1,0632	1,24	0,5316	0,8610
EC-LC05	200	5	1,0630	1,24	0,5315	0,8609

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

Page 4

trang	4/7
Chuyển đổi dữ liệu	02.09.2016
Kích	0.66 Mb.
	#31541

Bảng 6. Khối lượng và thể tích tinh dầu trong lá Bạch đàn chanh thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước theo thời gian

Mẫu	Khối ượng mẫu (gam)	Thời gian chiết (giờ)	Khối lượng tinh dầu (gam)	Thể tích tinh dầu (ml)	Phần trăm khối lượng tinh dầu trên lá tươi (%)	Tỉ khối (g/ml)
ECI-LC01	200	1	2,0200	2,67	1,01	0,7501
ECI-LC02	200	2	2,2000	2,93	1,10	0,7508
ECI-LC03	200	3	2,3800	3,17	1,19	0,7510
ECI-LC04	200	4	2,6000	3,34	1,33	0,7670
ECI-LC05	200	5	2,6000	3,34	1,33	0,7670

Từ bảng số liệu trên cho thấy thời gian chưng cất tối ưu là 4 giờ sẽ thu được khối lượng tinh dầu lớn nhất. Tỉ lệ tinh dầu thu được sau thời gian này là 1,33 % tính trên mẫu lá tươi. Tỉ khối thay đổi không nhiều, từ 0,7501 g/ml đến 0,7670 g/ml và nhẹ hơn tinh dầu của loài Bạch đàn trắng.

Đối với loài Bạch đàn xanh (E. globulus) trồng tại Xuân Mai, huyện Chương Mỹ, thành phố Hà Nội được thu hái vào ngày 20 tháng 08 năm 2010, kết quả nghiên cứu được nêu trong Bảng 7. Từ số liệu này cho thấy cũng giống như loài E. camaldulensis, loài E. globulus sau khi cất lôi cuốn 4 giờ thu được khối lượng tinh dầu cực đại từ mẫu nghiên cứu, đạt 0,3250 % tính trên mẫu lá tươi. Tỉ khối của mẫu tinh dầu thu được dao động từ 0,7508 g/ml đến 0,7784 g/ml.

Bảng 7. Khối lượng và thể tích tinh dầu trong lá Bạch đàn xanh thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước theo thời gian

Mẫu

Khối lượng mẫu (gam)

Thời gian chiết (giờ)

Khối

lượng

tinh dầu

(gam)

Thể tích

tinh dầu

(ml)

Phần trăm khối lượng tinh dầu trên lá tươi (%)

Tỉ khối

(g/ml)

EG-LC01

200

0,5050

0,6675

0,2525

0,7508

EG-LC02

200

0,5500

0,7325

0,2750

0,7509

EG-LC03

200

0,5950

0,7925

0,2975

0,7566

EG-LC04

200

0,6500

0,8350

0,3250

0,7784

EG-LC05

200

0,6500

0,8350

0,3250

0,7784

Qua kết quả khảo sát khối lượng tinh dầu thu được trong các khoảng thời gian chưng cất khác nhau đã xác định được khối lượng tinh dầu đạt cực đại của hai loài Bạch đàn cùng với tỷ trọng của nó khi cất lôi cuốn bằng hơi nước ở 980C trong 4 giờ được mô tả ở Bảng 8, trong đó tỉ lệ phần trăm khối lượng tinh dầu tính trên mẫu lá tươi.

Bảng 8. Phần trăm khối lượng và tỉ khối của tinh dầu trong lá

các loài Bạch đàn nghiên cứu

Bạch đàn trắng

(E. camaldulensis)

Bạch đàn xanh

(E. globulus)

Bạch đàn chanh

(E. citriodora)

Phần trăm khối lượng (%)

Tỉ khối

(g/ml)

Phần trăm khối lượng (%)

Tỉ khối

(g/ml)

Phần trăm

khối lượng

(%)

Tỉ khối

(g/ml)

0,5010

0,8610

0,3250

0,7784

1,33

0,7670

Hình 5. Mầu của tinh dầu các loài Bạch đàn thu được bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước

Mầu của tinh dầu Bạch đàn khá khác nhau (Hình 5). So sánh tỉ lệ phần trăm khối lượng tinh dầu của ba loài Bạch đàn nghiên cứu tính trên khối lượng mẫu lá tươi thì loài Bạch đàn chanh (E. citriodora) có khối lượng tinh dầu là lớn nhất đạt 1,33%, tiếp đến là loài Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) đạt 0,5316 % và thấp nhất là loài Bạch đàn xanh (E. globulus) đạt 0,3250 %. Về tỉ khối tinh dầu của loài Bạch đàn trắng có tỉ khối nặng nhất là 0,8610 g/ml, tiếp đó đến tinh dầu loài Bạch đàn xanh đạt 0,7784 g/ml và thấp nhất là tinh dầu của loài Bạch đàn chanh, đạt 0,7670 g/ml. Tỉ lệ khối lượng tinh dầu loài Bạch đàn trắng là 0,51 %, cao hơn so với nghiên cứu công bố của Lã Đình Mỡi (0,14 đến 0,28 %), còn loài Bạch đàn chanh trong nghiên cứu này là 1,33 %, thấp hơn so với nghiên cứu của Nguyễn Xuân Dũng (1,8 đến 2,0 %). Nghiên cứu tại Trung Quốc cho thấy tỉ lệ khối lượng của tinh dầu Bạch đàn chanh từ 0,5 % đến 2,0 %, còn với loài Bạch đàn xanh tinh dầu chiếm từ 1,0 đến 2,9 %. Trong nghiên cứu này cho tỉ lệ khối lượng tinh dầu Bạch đàn xanh chỉ có 0,35 %. Sự khác biệt về tỉ lệ khối lượng tinh dầu như đã nói trên do ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố như nguồn giống, phương pháp trồng và chăm sóc, thời điểm thu hái và điều kiện thổ nhưỡng.

3.2. Thành phần hóa học trong tinh dầu Bạch đàn

3.2.1. Thành phần hóa học tinh dầu Bạch đàn trắng

Sản phẩm tinh dầu Bạch đàn thu được bằng hai phương pháp cất dòng ngưng liên tục và cất lôi cuốn hơi nước đều được sử dụng để phân tích xác định thành phần hóa học các chất có trong mẫu tinh dầu này.

Với phương pháp cất dòng ngưng liên tục

- Sản phẩm tinh dầu Bạch đàn thu được bằng phương pháp cất dòng ngưng liên tục hòa tan trực tiếp trong dung môi điclometan như trong mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Do đó phương pháp này sẽ không cho biết được khối lượng tinh dầu trong mẫu lá cũng như tỉ khối của nó. Tuy nhiên phương pháp này lại có ưu điểm rất lớn đó là thiết bị chiết gọn nhẹ, lượng mẫu lấy nghiên cứu nhỏ, chỉ cần khoảng từ 5 gam đến 10 gam mẫu tươi, trong khi đó phương pháp cất lôi cuốn hơi nước cần đến 200 g. Sản phẩm sau khi chiết được phân tích ngay trên thiết bị sắc ký. Phương pháp cất dòng ngưng này rất thuận tiện cho việc nghiên cứu nhanh thành phần hóa học của tinh dầu thực vật.

- Kết quả phân tích các mẫu tinh dầu Bạch đàn thu được bằng phương pháp cất dòng ngưng liên tục theo các thời gian khác nhau bằng phương pháp sắc ký khí với detector FID (GC/FID) và và phương pháp sắc ký khí với detector khối phổ (GC/MS) cho thấy:

+ Số lượng các hợp chất hóa học có trong các mẫu tinh dầu Bạch đàn chiết trong các khoảng thời gian khác nhau (ít nhất là 1 giờ) không có sự khác nhau. Nếu tính các chất có hàm lượng trên 0,1 % trong mẫu tinh dầu thì đối với loài Bạch đàn trắng đều xác định được 39 hợp chất hóa học khác nhau; đối với loài Bạch đàn xanh xác định được 50 hợp chất hóa học khác nhau và đối với loài Bạch đàn chanh xác định được 40 hợp chất hoá học khác nhau.

+ Tỉ lệ phần trăm của các hợp chất hóa học có mẫu tinh dầu Bạch đàn có sự khác nhau nhất định theo thời gian chiết: trong khoảng thời gian chiết ngắn là 1 giờ thì tỉ lệ phần trăm của các hợp chất có nhiệt độ sôi thấp (các chất có thời gian lưu ngắn) như α –pinene, β-pinene, limonene, eucalyptol,... đều có tỉ lệ cao và các chất có nhiệt độ sôi cao (các chất có thời gian lưu dài) như β–eudesmol, γ–eudesmol, β–selinene thì chiếm tỉ lệ thấp hơn, ngược lại khi cất trong thời gian dài từ 2 giờ trở lên thì tỉ lệ trên lại đảo ngược lại tức là các chất có nhiệt độ sôi thấp sẽ chiếm tỉ lệ thấp còn các chất có nhiệt độ sôi cao sẽ chiếm tỉ lệ cao hơn. Nguyên nhân ở đây chủ yếu là do bản chất vật lý của chất, những chất có nhiệt độ sôi cao và phân tử lượng lớn như β–eudesmol, γ– eudesmol, β–selinene thì cần phải sau một thời gian cất đủ dài thì mới chiết rút hết ra được khỏi mô tế bào thực vật. Khi đó sẽ làm thay đổi tỉ lệ giữa các chất có trong mẫu tinh dầu.

Đối với phương pháp cất lôi cuốn hơi nước

Kết quả phân tích tinh dầu Bạch đàn trên thiết bị GC/FID và GC/MS cũng cho thấy rằng kết quả phân tích tương tự như đối với tinh dầu Bạch đàn thu được bằng phương pháp cất dòng ngưng liên tục, mặc dù có sự khác biệt về thời gian chiết mẫu. Phải sau thời gian chưng cất mẫu 4 giờ trở lên thì mới nhận được các chất có nhiệt độ sôi cao với tỉ lệ lớn nhất.

Như vậy so sánh ưu nhược điểm của hai phương pháp chưng cất tinh dầu Bạch đàn thì thấy nếu sử dụng phương pháp cất dòng ngưng liên tục thì chỉ cần thời gian chiết mẫu 2 giờ ở nhiệt độ 1000C và sử dụng lượng mẫu là 10 gam là có thể xác định được toàn diện thành phần hóa học các chất có mặt trong mẫu tinh dầu Bạch đàn. Tuy nhiên, để xác định được cả tỉ lệ khối lượng tinh dầu trong mẫu nghiên cứu thì phải sử dụng phương pháp cất lôi cuốn hơi nước, và thời gian cất lôi cuốn hơi nước là 4 giờ liên tục với nhiệt độ hơi nước là 980C. Dưới đây là sắc đồ phân tích tinh dầu Bạch đàn trắng bằng phương

pháp sắc ký khí với detectơ ion hóa ngọn lửa (GC-FID) và sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC-MS), hình 6 a và hình 6 b.

Hình 6 (a). Sắc đồ phân tích mẫu tinh dầu lá Bạch đàn trắng

(E. camaldulensis) bằng phương pháp GC/FID

Hình 6 (b). Sắc đồ phân tích mẫu tinh dầu lá Bạch đàn trắng

(E. camaldulensis) bằng phương pháp GC/MS

Từ kết quả phân tích tinh dầu bằng hai phương pháp GC/FID và GC/MS cho thấy số lượng của các hợp chất phát hiện được trong mẫu tinh dầu không có sự khác nhau. Số lượng các hợp chất phát hiện thấy trong tinh dầu loài Bạch đàn trắng được là 39 chất và đã định danh được 17 chất (độ chính xác trên 95%), Bảng 9.

Bảng 9. Một số chất chính trong tinh dầu lá Bạch đàn trắng

(E. camaldulensis) trồng tại Xuân Mai

TT	Tên chất	Thời gian lưu trên GC (phút)	Thời gian lưu trên GC/MS (phút)	Hàm lượng (%)	Hàm lượng theo công bố (%) [4]
	α -pinene	1,453	11,740	13,2	6,91
	camphene	1,637	12,563	0,8	0,22
	β-pinene	1,923	13,963	10,5	7,67
	β-myrcene	2,020	14,549	0,3	0,38
	p-cymene	2,310	16,372	0,1	1,20
	limonene	2,460	16,604	14,4	-
	eucalyptol (1-8 cineole)	2,723	16,779	32,6	64,79
	γ-terpinene	2,930	18,027	0,4	4,5
	Fenchyl alcohol (fenchol)	3,967	20,24	1,0	0,12
	Terpinen-4-ol	4,510	21,960	1,0	1,37
	α -terpineol	5,060	22,358	3,7	1,99
	methyl eugenol	6,027	27,488	0,2	-
	aromadendrene	6,633	28,648	1,3	-
	β-patchoulene	7,857	31,622	0,4	-
	β -selinene	8,140	32,183	1,9	0,13
	γ - eudesmol	8,660	33,191	2,2	-
	β -eudesmol	8,853	33,761	6,9	0,24

Trong Bảng 9 chất có hàm lượng cao nhất là eucalyptol (còn gọi là 1-8 cineole), hình 7, chiếm tới 32%. Đây là chất chính và được coi như là chất đặc trưng cho tinh dầu Bạch đàn trắng. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hằng Thái tỉ lệ phần trăm của hợp chất này là 64,79 %. Bên cạnh đó một số hợp chất khác limonene (14,4 %), α–pinene (13,2 %), β-pinene (10,5 %), β –eudesmol (6,9 %), α–terpineol (3,7 %) cũng có tỉ lệ khá cao. Trong tinh dầu loài Bạch đàn trắng còn có nhiều chất có hàm lượng nhỏ dưới 3 – 4 %. Đặc biệt trong nghiên cứu này đã xác định được 5 hợp chất hóa học mà chưa thấy công bố trong các nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước, các hợp chất đó là: limonene (14,4 %), methyl eugenol (0,2 %), alloaromadendrene (1,3 %), γ – eudesmol (2,2 %).

Hình 7. Phổ m/z của 1-8 cineole trong mẫu phân tích và thư viện phổ

3.2.2. Thành phần hóa học trong tinh dầu Bạch đàn xanh

Kết quả phân tích các mẫu tinh dầu loài E. globulus trên hai thiết bị sắc ký GC/FID và GC/MS, hình 5 (a) và 5 (b) đã xác định được 52 hợp chất hóa học khác nhau.

Hình 8 (a). Sắc đồ phân tích mẫu tinh dầu từ lá Bạch đàn xanh

(E. globulus) bằng phương pháp GC-FID

Hình 8 (b). Sắc đồ phân tích mẫu tinh dầu từ lá Bạch đàn xanh

(E. globulus) bằng phương pháp GC-MS

Bằng phương pháp GC/MS đã định danh được 18 hợp chất khác nhau có mặt trong tinh dầu loài E. globulus được mô tả ở Bảng 10 với hàm lượng từ 0,2% trở lên và độ chính xác ≥ 95%.

Bảng 10. Một số chất chính trong tinh dầu lá Bạch đàn xanh

(E. globulus) trồng tại Xuân Mai, Hà Nội

TT	Tên chất	Thời gian lưu trên GC	Thời gian lưu trên GC/MS	Hànm lượng (%)	Hàm lượng (%) theo công bố [4]
	α -pinene	1,453	11,738	27,3	-
	β-pinene	1,923	13,958	8,2	-
	β - cymene	2,023	16,369	0,2	-
	limonene	2,443	16,594	1,86	-
	eucalyptol (1-8 cineole)	2,713	16,779	1,2	11,8
	α - terpineol	5,060	22,359	1,37	-
	geranyl isobutyrate	6,037	26,901	0,82	-
	β -caryophyllene	6,533	28,192	8,5	-
	aromadendrene	6,653	28,649	9,6	25,1
	α - caryophyllene	6,817	29,067	1,0	-
	alloaromadendrene	6,903	29,177	1,4	-
	viridiflorene	7,183	29,887	1,2	-
	spathulenol	8,153	31,961	3,8	-
	beta-caryophyllene oxide	8,233	32,109	4,5	-
	longifolene	8,287	32,183	8,2	-
	Valencene	8,710	33,192	2,3	-
	beta-eudesmol	8,850	33,758	1,30	-
	palmitic acid	11,850	39,104	13,33	-

Kết quả nghiên cứu được chỉ ra ở trên cho thấy các hợp chất hóa học trong tinh dầu chủ yếu thuộc hai nhóm monoterpenes và sesquiterpenes, trong đó α–pinene (Hình 9) chiếm tỉ lệ cao nhất đạt 27,3 %, tiếp đó là axit palmitic 13,3 %, aromadendrene 9,6 %, β – caryophyllene 8,5 % và β-pinene 8,2 %. Các hợp chất khác có hàm lượng nhỏ hơn. So sánh với kết quả nghiên cứu về tinh dầu của loài Bạch đàn này tại Bồ Đào Nha [4] thì thấy có sự khác nhau đáng kể về hàm lượng của các hợp chất chính kể trên, cụ thể aromadendrene đạt tới 25,1 %, eucalyptol 11,8 %, α-phellandrene 17,2 % và globulol 5,23 %.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

Page 5

Hình 9. Phổ m/z của α –pinene trong mẫu phân tích và thư viện phổ

3.2.3. Thành phần hóa học trong tinh dầu Bạch đàn chanh

Kết quả phân tích các mẫu tinh dầu Bạch đàn chanh tách chiết được bằng hai phương pháp khác nhau trên hai thiết bị GC/FID và GC/MS được chỉ ra trong hình 10 (a) và hình 10 (b). Dựa trên sắc đồ đã xác định được 35 hợp chất hóa học khác nhau.

Hình 10 (a). Sắc đồ phân tích mẫu tinh dầu

từ lá Bạch đàn chanh (E. citriodora) bằng GC/FID

Hình 10 (a). Sắc đồ phân tích mẫu tinh dầu

từ lá Bạch đàn chanh (E. citriodora) bằng GC/MS

Sử dụng kỹ thuật GC/MS đã định danh được sự có mặt của 11 hợp chất hóa học có mặt trong tinh dầu loài E. citriodora, Bảng 11.

Bảng 11. Một số chất hóa học chính trong tinh dầu lá Bạch đàn chanh

(E. citriodora) trồng tại Lục Lam, Bắc Giang

TT	Tên chất	Thời gian lưu trên GC	Thời gian lưu trên GC/MS	Hànm lượng (%)	Hàm lượng (%) theo công bố [4]
	α -pinene	1,450	11,743	0,1	0,1
	β-pinene	1,917	13,967	0,3	0,4
	Myrcene	2,023	14,552	0,1	-
	β-oximene	2,710	16,941	0,1	-
	Linalool	3,653	19,600	0,1	-
	citrolellal	4,680	21,147	84,3	72,53
	isopulegol	4,843	21,366	1,3	12,5
	Glyoxime	4,900	21,921	0,1	-
	β-citronellol	5,263	23,099	6,9	5,61
	(-)-lavandulol	5,563	23,711	0,4	-
	β -caryophyllene	6,637	28,191	0,3	0,4

Từ Bảng 11 cho thấy, citrolelal là chất chính, chiếm 84,3 % trong tinh dầu loài Bạch đàn chanh (E. citriodora) trồng tại Lục Lam, tỉnh Bắc Giang thu hái vào tháng 8/2010, cao hơn nhiều so với nghiên cứu của Nguyễn Xuân Dũng [4] và tương tương với nghiên cứu của Boland tại Australia (80,1%) [11]. Các hợp chất còn lại có hàm lượng nhỏ và không đáng kể.

Từ kết quả nghiên cứu xác định về thành phần hóa học trong tinh dầu lá của 3 loài Bạch đàn cho thấy, thành phần hóa học trong tinh của chúng là khá khác nhau về nồng độ phần trăm của chất cũng như về số lượng các chất. Loài Bạch đàn chanh (E. citriodora) có chứa ít các hợp chất hóa học nhất so với hai loài Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) và loài Bạch đàn xanh (E. globulus). Điểm nổi bật của loài Bạch đàn chanh là hàm lượng hợp chất citronellal, hình 11 chiếm tới 84,3%. Đối với loài Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) hợp chất có nồng độ cao nhất là eucalyptol chiếm 32 %, còn loài Bạch đàn xanh (E. globulus) hợp chất có nồng độ cao nhất là α –pinene với 22,6 %. Như vậy tinh dầu loài Bạch đàn chanh sẽ trở lên rất có ý nghĩa vì nó có chứa hàm lượng chất citronellal rất cao.

Hình 11. Phổ m/z của citronellal trong mẫu phân tích và thư viện phổ

3.3. Hoạt tính sinh học của một số chất chính trong tinh dầu Bạch đàn

Trên cơ sở các hợp chất hóa học xác định được của ba loài Bạch đàn đã lấy nghiên cứu, đề tài lựa chọn các hợp chất hóa học đặc trưng cho từng loài để tính toán, dự đoán hoạt tính sinh học sử dụng chương trình tính toán PASS. Đầu vào của chương trình tính toán PASS là thông tin về hợp chất cần nghiên cứu như cấu trúc hóa học, công thức phân tử và danh pháp. Chương trình tính toán PASS sẽ tự động tính toán thông qua việc so sánh cấu trúc của chất nghiên cứu với cấu trúc của các chất có trong phổ PASS, từ đó sẽ chỉ ra xác suất Pa về sự có mặt hoạt tính sinh học và xác suất Pi không có mặt một hoạt tính sinh học nào đó của chất. Một chất được coi có một hoạt tính sinh học nào đó khi Pa – Pi > 0 và Pa phải > 0,7. Đồng thời độ chính xác của PASS dự đoán cho một hoạt tính sinh học của chất sẽ được thỏa đáng khi mà số hợp chất có trong cơ sở dữ liệu có tính chất đó lớn hơn 5. Dưới đây là kết quả dự đoán hoạt tính sinh học cho một số chất điển hình của tinh dầu Bạch đàn.

3.3.1. Hoạt tính sinh học của Citronellal

Citronelelal là một chất chiếm chủ yếu trong thành phần tinh dầu loài Bạch đàn chanh, tới 84,3%. Đây là một chất thuộc nhóm monoterpenoid có một số tính chất như sau.

- Công thức phân tử: C10H18O

- Danh pháp quốc tế (IUPAC) : 3,7-dimethyloct-6-en-1-al

- Trọng lượng phân tử: 154,25 đvC

- Nhiệt độ sôi: 201-2070C

- Công thức cấu tạo của citronellal

Hoạt tính sinh học của chất này được dự đoán dựa trên cấu trúc phân tử của nó được nêu trong Bảng 12.

Sau khi sàng lọc đã chọn được 18/31 hoạt tính sinh học khác nhau với xác suất Pa có mặt tính chất đó là > 0,7 và thoả mãn số các hợp chất có tính chất đó > 5. Trong các hoạt tính trên được mô tả chủ yếu chúng có tác động hóa sinh đến cơ thể sinh vật như sự ức chế tổng hợp (-)-(4S)-limonene, hay như điều trị sự lây lan của tế bào nhiễm bệnh, ức chế các enzim trong cơ thể sinh vật, kháng bài tiết. Hầu hết các hoạt tính này đều gây bất lợi đối với cơ thể sinh vật. Citronellal đã được các nhà khoa học trên thế giới xếp vào nhóm chất nguy hại (Xn-N) và gây nguy hiểm cho môi trường. Giá trị LD50 qua đường tiêu hóa đối với chuột là 2420 mg/kg, cho thỏ tiếp xúc tiếp xúc qua da là > 2400 mg/kg [17].

Bảng 12. Hoạt tính sinh học của citronellal tính toán trên PASS

Stt	Hoạt tính	Xác suất	Số chất có hoạt tính
Có	Không
	Kháng bài tiết	0,758	0,007	186
	Thần kinh yếu tố tăng trưởng agonist	0,771	0,003	22
	Ức chế men khử Protein-disulfide	0,892	0,005	11
	Kháng di căn (Antimetastatic)	0,757	0,033	11
	Trị phát tán tế bào gây bệnh	0,705	0,012	11
	Ức chế men khử Ubiquinol-cytochrome-c	0,835	0,026	10
	Ức chế tổng hợp Cycloartenol	0,802	0,004	10
	Kích thích emzim transferase	0,769	0,120	9
	Chất nền GST A	0,821	0,023	8
	Ức chế peptidase đơn	0,812	0,032	8
	Ức chế mem võng mạc	0,701	0,072	8
	Ức chế men khử Carboxylate	0,858	0,002	7
	Ức chế Phosphatase	0,857	0,010	7
	Ức chế men khử Plastoquinol-plastocyanin	0,754	0,002	7
	Ức chế tổng hợp (-)-(4S)-limonene	0,820	0,004	6
	Ức chế Polyporopepsin	0,826	0,024	6
	Ức chế dehydrogenase Allyl-alcohol	0,779	0,005	6
	Ức chế Dolichyl-phosphatase	0,770	0,003	6
	Ức chế Prenyl-diphosphatase	0,835	0,004	5
	Ức chế enzim chuyển đổi Pro-opiomelanocortin	0,828	0,018	5
	Ức chế Limulus clotting nhân tố B	0,778	0,008	4
	Ức chế Limulus clotting nhân tố C	0,731	0,012	4
	Ức chế All-trans-retinyl-palmitate hydrolase	0,704	0,013	4
	Ức chế Phosphatidylcholine-retinol O-acyltransferase	0,708	0,018	4
	Ức chế TERT expression	0,818	0,005	3
	Ức chế Undecaprenyl-phosphate mannosyltransferase	0,817	0,006	3
	Ức chế Testosterone 17beta-dehydrogenase (NADP+)	0,822	0,027	3
	Ức chế Acrocylindropepsin	0752	0,044	3
	Ức chế Chymosin	0,752	0,044	3
	Ức chế Saccharopepsin	0,752	0,044	3
	Ức chế Glutarate-semialdehyde dehydrogenase	0,704	0,007	3

Các chỉ dẫn về độc tính của nó được mô tả như sau:

R 43 - có thể gây kích thích khi tiếp xúc với da;

R 63 - gây nguy hại cho thai nhi;

S 02 - giữ xa tầm tay của trẻ em;

S 23 - không được hít phải hơi;

S 26 - trong trường hợp trực tiếp khi tiếp xúc với mắt phải ngay lập tức rửa bằng nước và dùng thuốc điều trị [17].

3.3.2. Hoạt tính sinh học của β–Caryophyllene

β-caryophyllene chiếm 5,79 % trong tinh dầu loài E. globulus và 0,31% trong tinh dầu loài E. citriodora. Đây là một chất đã được xếp vào nhóm chất nguy hại, có thể gây hại cho phổi nếu như hít thở phải chúng [18]. giá trị LD50 cho chuột qua đường tiêu hóa (cả con đực và cái) là 5000 mg/kg. Một số tính chất của nó được mô tả như sau:

- Công thức phân tử: C15H24;

-Danh pháp quốc tế (IUPAC): 4,11,11-trimethyl-8-methylene-

bicyclo[7.2.0]undec-4-ene;

- Trọng lượng phân tử: 204,36;

- Nhiệt độ sôi: 256,000C đến 259.00 °C ở 760,00 mm Hg;

- Khả năng hoà tan: tan tốt trong dung môi hữu cơ và hầu như không tan trong nước;

- Công thức cấu tạo:

Trong thực tế hợp chất β–caryophyllene tách chiết từ loài cỏ roi ngựa (Verbenaceae) đã được tác giả LIU Yu-Qing và cộng sự chứng minh nó có độc tính rất cao đối với loài Aphis gossypii Glover (rệp vừng), họ Aphididae thuộc bộ Homoptera (bộ cánh đều). Giá trị LD50 nghiên cứu trên một cá thể là 0,65.10-1/cá thể. Hoạt tính sinh học của β–caryophyllene và α-pinene đã được nhóm tác giả nghiên cứu trong điều kiện in vivo và in vitro chỉ ra khả năng ức chế các men trong cơ thể loài Aphis gossypii Glover như acetylcholine esterase, polyphenol oxidase, carboxylesterase and glutathione S-tramsferases [7]. Như vậy với hàm lượng đến 5,79 % trong tinh dầu loài E. globulus thì tinh dầu loài Bạch đàn này sẽ là một nguồn quan trọng có thể sử dụng để nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu bệnh hại nguồn gốc thảo mộc, an toàn đối với môi trường.

3.2.3. Hoạt tính sinh học α-Pinene

α-Pinene là hợp chất chiếm tỉ lệ cao nhất của loài E. globulus với 24,46 %, trong loài E. camaldulelsis nó cũng chiếm tới 6,49 % đứng thứ hai sau eucalyptol (1-8 cineole). α-pinene có một số tính chất sau:

- Công thức phân tử: C10H16;

- Danh pháp quốc tế (IUPAC): (1S,5S)-2,6,6-Trimethyl

bicyclo [3.1.1] hept-2-ene;

- Nhiệt độ sôi: 1150C ở 760mm Hg;

- Khả năng hòa tan: tan tốt trong dung môi hữu cơ và hầu như không tan trong nước.

- Công thức cấu tạo:

Căn cứ vào công thức cấu tạo, tính toán trên PASS thì α-pinene có các hoạt tính sinh học như nêu trong Bảng 13.

Bảng 13. Hoạt tính sinh học của α-Pinene tính toán trên PASS

TT	Hoạt tính	Xác suất	Số chất có hoạt tính
Có	Không
1	Giảm kích thích thần kinh	0,834	0,010	48
2	Chống rối loạn vận động	0,733	0,012	22
3	Trị viêm kết mạc dị ứng	0,706	0,003	21
4	Trợ tim	0,836	0,005	19
5	Cơ chất CYP2C12	0,771	0,054	11
6	Ức chế men khử axit axetoaxetic	0,780	0,048	10
7	Chất kích thích Transferase	0,899	0,036	9
8	Ức chế Alpha-pinene-oxide decyclase	0,785	0,002	8
9	Ức chế men xúc tác oxi hóa Retinal	0,778	0,048	8
10	Trị viêm cứng đốt sống	0,752	0,037	7
11	Ức chế (+)-borneol dehydrogenase	0,710	0,004	6
12	Ức chế Steroid 21-monooxygenase	0,735	0,032	6
13	Ức chế 27-Hydroxycholesterol 7alpha-monooxygenase	0,711	0,014	6
14	Cơ chất CYP2C9-Cys144	0,709	0,036	6
15	Ức chế Alkenylglycerophosphocholine hydrolase	0,730	0,035	5
16	Ức chế Phosphatidylcholine-retinol O-acyltransferase	0,768	0,011	4
17	Ức chế All-trans-retinyl-palmitate hydrolase	0,745	0,009	4
18	Cơ chất CYP2J	0,733	0,035	4
19	Cơ chất CYP2J2	0,733	0,035	4
20	Ức chế Alkylacetylglycerophosphatase	0,710	0,025	4
21	Đối khánh Prostaglandin E1	0,891	0,002	3
22	Ức chế Testosterone 17beta-dehydrogenase (NADP+)	0,865	0,016	3
23	Ức chế men 5-O-(4-coumaroyl)-D-quinate 3'-monooxygenase inhibitor	0,792	0,011	3
24	Ức chế men Acylcarnitine hydrolase	0,708	0,037	3

Trong số các hoạt tính nêu trong Bảng 13, α-pinene có rất nhiều những hoạt tính có thể được ứng dụng làm thuốc trong trị bệnh như giảm kích thích thần kinh (Antineurotic), trị viêm da kết mạc dị ứng (Allergic conjunctivitis treatment), trị viên cứng đốt sống (Ankylosing spondylitis treatment),... Ngoài ra α-pinene còn có các hoạt tính gây bất lợi cho các cơ thể sinh vật khác như các hoạt tính gây ức chế một số loại men. Chính những tính chất này mà α-pinene có thể được sử dụng làm một số loại thuốc trừ sâu bệnh. Các thông tin về độc học sinh thái của hai hợp chất α-pinene và β- pinene đã được Cộng đồng chung Châu Âu công bố với chất tinh khiết có ý nghĩa quan trọng trong việc định hướng nghiên cứu ảnh hưởng đến môi trường sinh thái của các loài cây có chứa các hợp chất này, Bảng 14.

Chia sẻ với bạn bè của bạn:

Page 6

trang	6/7
Chuyển đổi dữ liệu	02.09.2016
Kích	0.66 Mb.
	#31541

Bảng 14. Độc học sinh thái của α-pinene và β-pinene [7]

Chất

Độc sinh thái

α-pinene

LC50 = 0,28 mg/l trong 96 h, với loài Pimephales promelas;

LC50 = 1 mg/l trong 96 h với loài Chaetogammarus marinus;

EC50 = 41 mg/l trong 48 h với loài Daphnia magna;

β- pinene

EC50 = 1,25 mg/l trong 48 h với Daphnia;

EC50 = 1,44 mg/l trong 48 h với Green algae

3.2.4. Hoạt tính sinh học của Eucalyptol

Eucalyptol (còn gọi là 1-8 cineole) là hợp chất chính của tinh dầu loài Bạch đàn trắng (E. camaldulelsis), chiếm 32%.

- Danh pháp quốc tế (IUPAC): 1,3,3-trimethyl- 2-oxabicyclo[2,2,2]octane;

- Nhiệt độ sôi: 176-1770C ở 760 mm Hg;

- Tỉ khối: 0,9225 g/cm3;

- Công thức phân tử: C10H18O

- Công thức cấu tạo:

- Eucalyptol có khả năng hoà tan tốt trong dung môi hữu cơ và hầu như không tan trong nước.

Theo kết quả tính toán dự đoán hoạt tính sinh học của chất Eucalyptol dựa trên chương trình tính toán PASS, Eucalyptol có các hoạt tính sinh học được nêu trong Bảng 15. Các hoạt tính này là tổ hợp các hoạt tính có được từ 5 cấu trúc phân tử ở hình 12.

Bảng 15. Hoạt tính sinh học của của Eucalyptol tính toán trên PASS

TT	Hoạt tính	Xác suất	Số chất có hoạt tính
Có	Không
	Kháng khuẩn	1,000	0,000	321
	Diệt sán	1,000	0,000	437
	Diệt ký sinh trùng	1,000	0,000	349
	Long đờm	1,000	0,000	291
	Kháng sinh	1,000	0,000	390
	Kháng Salmonella	1,000	0,000	82
	Cơ chất CYP3A	1,000	0,000	21
	Cơ chất CYP3A4	1,000	0,000	19
	Cơ chất CYP3A5	1,000	0,000	23
	Trị rối loạn gan	0,744	0,004	415
	Cơ chất CYP3A1	0,721	0,010	52
	Cơ chất Alcohol dehydrogenase	0,982	0,000	42
	Cơ chất Aldehyde dehydrogenase	0,886	0,000	30
	Antidyskinetic	0,766	0,008	22
	Kháng vi rút	0,701	0,023	19
	Cơ chất CYP2C12	0,907	0,014	11
	Kháng tăng tiết bã nhờn dầu	0,753	0,041	11
	Kháng di căn	0,731	0,043	11
	Ức chế men khử Ubiquinol-cytochrome-c	0,742	0,064	10
	Lợi nước bọt	0,706	0,028	10
	Kích thích Transferase	0,869	0,057	9
	Cơ chất CYP2A2	0,716	0,007	8
	Trị viên đốt sống và cứng khớp	0,745	0,039	7
	Cơ chất CYP2C9-Cys144	0,801	0,014	6
	Ức chế Steroid 21-monooxygenase	0,755	0,027	6
	Ức chế Alkenylglycerophosphocholine hydrolase	0752	0,032	5
	Ức chế Alkylacetylglycerophosphatase	0,759	0,018	4
	Cơ chất CYP2J	0,752	0,030	4
	Cơ chất CYP2J2	0,752	0,030	4
	Ức chế TERT	0,944	0,001	3
	Ức chế Testosterone 17beta-dehydrogenase	0,860	0,017	3
	Ức chế Acylcarnitine hydrolase	0,820	0,017	3
	Cơ chất CYP2B5	0,712	0,010	3
	Ức chế Acrocylindropepsin	0,730	0,051	3
	Ức chế Chymosin	0,730	0,051	3
	Ức chế Saccharopepsin	0,730	0,051	3

(1) (2) (3) (4) (5) Eucalyptol

Hình 12. Các cấu trúc phân tử chính đóng góp vào hoạt tính

sinh học của Eucalyptol

Các cấu trúc (2), (3), (5) trong Hình 12 là những cấu trúc đóng góp nhiều nhất vào các hoạt tính sinh học của Eucalyptol bởi do nhóm -CH3 liên kết với C trong vòng 6 cạnh có một nguyên tử oxi.

Chương trình PASS đã chỉ ra 36 loại hoạt tính sinh học, trong đó có tới 24 hoạt tính sinh học đảm bảo các yêu cầu đặt ra (Pa > 0,7 và số các hợp chất có tính chất đó > 5 chất). Điểm nổi bật của hợp chất tự nhiên này là có rất nhiều các hoạt tính có tác dụng làm sạch môi trường như diệt khuẩn (antibacterial), diệt ký sinh trùng (antiparasitic), diệt sán (antihelmintic), kháng sinh (antibiotic),... Trong trị bệnh, hợp chất này có rất nhiều các tính chất quý như long đờm (expectorant), kháng vi rút (antiviral), kháng tăng tiết bã nhờn. Đặc biệt PASS dự đoán 5 hoạt tính đầu tiên với sác xuất có mặt tính chất đó là 100% (Pa = 1). Bên cạnh các hoạt tính trên, Eucalyptol (1-8 cineole) còn có nhiều hoạt tính có tác dụng gây ức chế một số men trong cơ thể sinh vật. Chính những hoạt tính sinh học đã nêu là cơ sở khoa học góp phần làm sáng tỏ các hiện tượng trong tự nhiên như khả năng xua đuổi côn trùng, đặc biệt là muỗi dưới tán rừng Bạch đàn, làm khô đất. Một trong những nguyên nhân có thể đóng góp vào việc giải thích sự ức chế kìm hãm các loài thực vật khác dưới tán rừng Bạch đàn đó là do các hợp chất hóa học trong tinh dầu từ lá của loài này khi rơi xuống đất, khi đó các hoạt tính sinh học của nó sẽ được phát huy đối với hệ sinh vật đất, làm tiêu diệt cả các vi sinh vật có ích mà chúng vốn có tác dụng làm tơi xốp đất đai, phân giải các chất hữu cơ phục hồi đất, góp phần làm gia tăng sự nghèo kiệt đất đai dưới tán rừng Bạch đàn.

Với các hoạt tính sinh học dự đoán ở trên, trong thực tế hiện nay Eucalyptol đã được sử dụng là thuốc trị bệnh với chỉ định sát trùng đường hô hấp, trị ho, hạ sốt.

Vấn đề độc học sinh thái liên quan đến hợp chất này đã được một số tác giả chứng minh bằng thực nghiệm. Kết quả chỉ ra rằng Eucalyptol có tính độc đối với loài M. domestica. Giá trị LD50, LD95 và LD99 được cho ở Bảng 16.

Bảng 16. Độc tính của Eucalyptol kháng lại loài Musca domestica

và Chrysomya megacephala [17]

Giới tính	M.domestica	C. megacephala
LD50

(95% CI)

Page 7

3.4.2. Tác động đến môi trường không khí

Tinh dầu Bạch đàn là hỗn hợp của rất nhiều các hợp chất hữu cơ thuộc nhóm dễ bay hơi. Do đó khi nhiệt độ môi trường tăng cao, đặc biệt ở nước ta lại là nước nhiệt đới, nhiệt độ vào mùa hè có thể đạt tới trên 300C sẽ tạo điều kiện để các tinh thể dầu bạch đàn có thể thoát ra ngoài các mô lá để khuyếch tán vào môi trường không khí. Với các hoạt tính đã nêu, khi tiếp xúc với các loài động vật như chim muông, thú, các loài côn trùng, đặc biệt qua con đường hô hấp, khi đó chúng sẽ phát huy tác dụng làm kích thích và dẫn đến suy hô hấp, ức chế một số loại men trong cơ thể động vật dẫn đến sự suy giảm số lượng loài hoặc xua đuổi một số loài côn trùng. Với các loài thực vật khác dưới tán rừng trồng Bạch đàn, khi tiếp xúc với tổ hợp các hợp chất có trong tinh dầu bay hơi từ lá Bạch đàn, chúng sẽ có tác dụng làm suy giảm chlorophill trong thực vật và tiêu diệt cỏ dại dẫn đến làm suy giảm tính đa dạng sinh học dưới rừng trồng Bạch đàn có thể thấy được ở Hình 14 và 15. Đây có có thể được xem là một trong số các nguyên nhân dẫn đến ảnh hưởng của rừng trồng Bạch đàn đối với các hệ sinh thái tại các quốc gia có điều kiện khí hậu khác nhau trên thế giới. Với lý do trên thì tác động bất lợi đến môi trường của rừng trồng Bạch đàn tại các quốc gia có khí hậu nóng ẩm chắc chắn sẽ lớn hơn tại các quốc gia có khí hậu lạnh.


Hình 14. Hệ sinh thái dưới tán rừng trồng Thông tại Xuân Mai, Hà Nội

Hình 15. Hệ sinh thái dưới tán rừng trồng Bạch đàn tại Xuân Mai, Hà Nội

Qua kết quả nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu Bạch đàn ở trên cho thấy chúng chứa hàm lượng cao các chất thuộc nhóm phenolic và terpenoid. Các hợp chất này có thể gây độc cho sinh vật và môi trường. Trong các hợp chất đó tiêu biểu là eucalyptol, citronellal, α-pinene, β-pinene, β–caryophyllene, β–eudesmol, isopulegol,... Hầu hết các kết quả nghiên cứu đều chỉ ra rằng các chất này đều có các phản ứng bất lợi đối với cơ thể sinh vật, trong đó đã được chứng minh trên các loài gặm nhấm. Một số trường hợp đã có những nghiên cứu về các phản ứng bất lợi nhằm hướng tới trên cơ thể con người.

Khi liều lượng tinh dầu vượt ngưỡng trên cơ thể người sẽ gây ra các hiện tượng như nóng rát thành dạ dày, đau nhức khoang bụng, gây nôn mửa và co giật, suy nhược hệ hô hấp và hệ thần kinh trung ương dẫn đến hôn mê và chết. Tuy nhiên những dữ liệu về việc gây tử vong ở người khi nuốt phải dầu bạch đàn chưa được khẳng định chắc chắn. Có thể dẫn đến tử vong khi nuốt phải lượng tinh dầu từ 4 ml đến 5 ml trong khi đó cũng có nghiên cứu khác cho rằng cơ thể người chỉ trở lên ốm yếu và có thể phục hồi nếu nuốt phải từ 120 – 200 ml tinh dầu. Nghiên cứu trên các loài gặm nhấm cho thấy giá trị LD50 (với thời gian tiếp xúc trong một ngày quan sát) qua đường tiêu hóa thì rất cao, giá trị đó là 4,44 g/kg trọng lượng cơ thể đối với chuột đồng và 3,33 g/kg đối với chuột nhắt. Khi chỉ có 1-8 cineole trong tinh dầu thì giá trị LD50 sẽ thấp hơn và bằng 2,48 g/kg đối với chuột đồng. Giá trị LD50 cho thỏ thì lớn nhất đến 5g/kg trọng lượng cơ thể. Đối với chất β–eudesmol giá trị LD50 cho chuột qua đường tiêu hóa là > 2 g/kg trọng lượng cơ thể và được xếp vào nhóm chất gây dị ứng kích thích da và mắt. Isopulegol là một hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu loài E. citriodora, đây là một chất được xếp vào nhóm chất gây hại và tránh nuốt phải và tiếp xúc trực tiếp với da và mắt, không được ăn, uống hay hít thở phải nó. Giá trị LD50 cho chuột qua đường miệng là 1030 μl/kg, đối với thỏ qua da là 3000 μl/kg. Hầu hết các hợp chất tìm thấy trong tinh dầu bạch đàn đều tan tốt trong các dung môi hữu cơ, trong các mô mỡ động vật nhưng lại tan rất ít trong nước. Do vậy các hợp chất này sẽ có khả năng tích lũy sinh học rất lớn, nó hòa tan và tồn lưu lại trong các mô mỡ của các loài động vật trong một thời gian dài và gây những bất lợi đối với cơ thể sinh vật [12, 13, 14, 17].

Tinh dầu Bạch đàn không có lợi cho bào thai và làm nhiễm bẩn sữa. Một vài nghiên cứu chỉ ra rằng citronellal và phellandrene có trong dầu Bạch đàn có thể làm suy yếu tế bào [14].

Bên cạnh những tác động bất lợi đối với một số vấn đề môi trường, một số hoạt tính của một số hợp chất có trong tinh dầu Bạch đàn qua nghiên cứu ở trên, xét ở một khía cạnh nào đó lại trở lên rất có giá trị trong cuộc sống như các hoạt tính kháng nấm, kháng vi khuẩn gây bệnh nên nó còn có tác dụng làm sạch môi trường. Đặc biệt với các hoạt tính như kháng Salmonella - một loại khuẩn làm nhiễm bẩn thực phẩm, kháng sinh, kháng vi rút, kháng di căn, trị viên đốt sống và cứng khớp,... của hợp chất Eucaluptol sẽ rất có giá trị trong nghiên cứu chế tạo dược phẩm để trị bệnh. Với hoạt tính có khả năng ức chế rất nhiều các loại men trong cơ thể sinh vật thì việc nghiên cứu tính kháng lại một số loài sâu bệnh của tinh dầu Bạch đàn cũng sẽ hứa hẹn cho những lợi ích to lớn trong bảo vệ môi trường.

Do hạn chế về thời gian nghiên cứu nên việc tiến hành nghiên cứu thử nghiệm trên sinh vật về hoạt tính sinh học của các hợp chất đối với một thực thể sinh học hoặc điều tra tính đa dạng sinh học dưới tán rừng trồng Bạch đàn tại những địa điểm nghiên cứu chưa được thực hiện. Hàm lượng và tỉ lệ các chất trong tinh dầu mới được nghiên cứu ở một cấp độ tuổi của cây, chưa có điều kiện nghiên cứu ở các cấp tuổi khác nhau và điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu ở các vùng miền khác nhau của nước ta. Đó là những đề cần được tiếp tục nghiên cứu trong thời gian tới và nghiên cứu ở cấp độ cao hơn hơn.

3.5. Một số giải pháp giảm thiểu những tác động xấu đến môi trường và sử dụng hiệu quả nguồn tinh dầu Bạch đàn ở nước ta

Căn cứ vào kết quả nghiên cứu, kết hợp với điều kiện thực tế ở nước ta hiện nay, việc trồng rừng Bạch đàn cần tính toán sao cho có hiệu quả nhất cả về lợi ích kinh tế lẫn môi trường. Trồng rừng Bạch đàn thuần loài thường dẫn đến làm khô và suy kiệt đất đai. Do vậy cần phải có chế độ phục hồi, bổ sung dinh dưỡng cho đất trong quá trình trồng và chăm sóc cây.

Bên cạnh làm suy kiệt đất đai, tinh dầu Bạch đàn chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao với hàm lượng lớn, tiêu biểu như Citronellal. Đây là hợp chất hóa học có nguồn gốc tự nhiên đã được cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (US. EPA) sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học do nó có tính xua đuổi nhiều loài muỗi và côn trùng khác, có khả năng chống nấm rất tốt. Trong nghiên cứu này đã chỉ ra hàm lượng chất Citronellal có trong tinh dầu loài E. citriodora là rất lớn, chiếm 84,3 %, đồng thời hàm lượng tinh dầu thu được trong lá của loài này cũng đạt giá trị lớn nhất trong số ba loài Bạch đàn đã nghiên cứu. Bên cạnh đó trong tinh dầu loài E. citriodora còn chứa một số hợp chất khác có hoạt tính diệt trừ côn trùng như isopulegol, β–caryophyllene. Trong tinh dầu loài Bạch đàn xanh và Bạch đàn trắng có chứa các hợp chất Eucalyptol (1-8 cineole), α-pinene, β- pinene, β–caryophyllene, β–eudesmol, isopulegol với tỉ lệ cao. Tất cả các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học diệt trừ và xua đuổi côn trùng, thậm chí còn có thể tiêu diệt cỏ dại. Ở một số quốc gia khác đã chế tạo thành công thuốc trừ sâu sinh học từ tinh dầu lá Bạch đàn để thay thế thuốc trừ sâu hóa học vốn rất độc hại với môi trường. Như vậy nếu tận dụng được phần loại bỏ khi khai thác gỗ Bạch đàn thì sẽ thu được một lượng sản phẩm rất lớn có ý nghĩa và thân thiện với môi trường đó chính là thuốc trừ sâu sinh học. Bên cạnh việc thu được thuốc trừ sâu sinh học còn có thể nhận được các sản phẩm đầu vào để tạo ra một số loại thuốc xoa bóp, thông mũi và điều trị nấm da đầu.

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ

1. Kết luận

Từ kết quả nghiên cứu của đề tài, có thể rút ra một số kết luận sau:

1. Đã đánh giá được hiệu quả, thời gian chiết tối ưu lá Bạch đàn bằng hai phương pháp tách chiết tinh dầu là phương pháp chiết dòng ngưng liên tục và phương pháp cất lôi cuốn hơi nước thông qua khối lượng và thành phần hoá học của tinh dầu;

+ Phương pháp cất lôi cuốn hơi nước: thời gian chiết 4 giờ với nhiệt độ 980C nhận được khối lượng tinh dầu lớn nhất từ mẫu lá nghiên cứu;

+ Phương pháp chiết dòng ngưng liên tục: thời gian chiết là 2 giờ ở nhiệt độ 1000C nhận được toàn diện thành phần các hợp chất hoá học trong tinh dầu;

2. Đã xác định được thành phần hóa học có trong tinh dầu lá của ba loài Bạch đàn: E. camaldulensis và E. globulus trồng tại Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội và E. citriodora trồng tại Lục Lam, Bắc Giang.

+ Loài E. camaldulensis đã xác định được sự có mặt của 39 hợp chất hoá học, chất chính là Eucalyptol (32,6%);

+ Loài E. globulus đã xác định được sự có mặt của 50 hợp chất hoá học, chất chính là α-pinene (27,3%);

+ Loài E. citriodora đã xác định được sự có mặt của 35 hợp chất hoá học, chất chính là Citrolelal (84,3 %).

3. Đã sử dụng chương trình tính toán PASS để dự đoán được hoạt tính sinh học của một số chất điển hình trong tinh dầu Bạch đàn là Eucalyptol, α-Pinene , β–Caryophyllene, Limonene. Các hoạt tính cơ bản của các chất này là: kháng nấm, kháng sinh, kháng vi khuẩn, kháng vi rút; ức chế các men trong cơ thể sinh vật, ức chế chlorophill thực vật; khả năng trị bệnh như long đờm, trị rối loạn gan, viêm kết mạc,...

4. Trên cơ sở kết quả dự đoán hoạt tính sinh học của các chất có mặt trong tinh dầu Bạch đàn và khảo sát thực tế đã nêu lên một số ảnh hưởng xấu liên quan giữa Bạch đàn với môi trường sinh thái tại những khu vực trồng rừng Bạch đàn.

Với những kết quả nghiên cứu đạt được đã mở ra một hướng nghiên cứu mới trong việc đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất có mặt trong tự nhiên đến môi trường sinh thái; đây cũng là hướng nghiên cứu làm cơ sở khoa học rút ra kết luận về độc học môi trường của các hợp chất trong tự nhiên, tạo tiền đề cho việc lựa chọn các chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tự nhiên phục vụ nghiên cứu thử nghiệm trên một thực thể sinh học cụ thể;

Những kết quả nghiên cứu như vậy sẽ giúp tìm kiếm các loại thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc tự nhiên, thay thế các loại thuốc hóa học tổng hợp vốn rất độc hại đối với môi trường sinh thái.

2. Khuyến nghị

- Cần có những đánh giá thực trạng và quy hoạch lại vùng trồng rừng Bạch đàn ở nước ta hiện nay trên cơ sở bảo đảm giảm thiểu tối đa những nguy cơ làm suy thoái môi trường đất và tác động có hại đến động thực vật.

- Lựa chọn một số hệ sinh thái rừng Bạch đàn điển hình để nghiên cứu tính đa dạng sinh học, từ đó có điều kiện đánh giá một cách toàn diện tác động của Bạch đàn đến môi trường sinh thái;

- Cần tiếp tục nghiên cứu ở cấp cao hơn về thành phần hóa học trong tinh dầu lá Bạch đàn ở các cấp tuổi, trồng ở các địa phương khác nhau và trong các mùa khác nhau để tìm ra một số mối tương quan giữa chúng với chất lượng tinh dầu của Bạch đàn. Lựa chọn một số chất điển hình trong tinh dầu Bạch đàn để thử nghiệm hoạt tính sinh học, từ đó có thể lựa chọn loài Bạch đàn cho các chất có hoạt tính sinh học tốt nhất, thân thiện với môi trường để gieo trồng trên diện rộng.
- Cần tiếp tục nghiên cứu một cách sâu rộng hơn nữa về thành phần hóa học trong tinh dầu lá Bạch đàn ở các cấp tuổi khác nhau, trồng ở các địa phương khác nhau và trong các mùa khác nhau để tìm ra mối tương quan giữa chúng với chất lượng tinh dầu của Bạch đàn;

- Lựa chọn một số chất điển hình trong tinh dầu Bạch đàn để thử hoạt tính sinh học từ đó có thể lựa chọn loài Bạch đàn cho các chất có hoạt tính sinh học tốt nhất, thân thiện với môi trường để gieo trồng trên diện rộng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

	Ngô Kim Chi (2000), Mô hình định lượng, phương pháp thống kê trong nghiên cứu tương quan cấu trúc – hoạt tính các dẫn xuất Protoberberin, Luận án tiến sĩ hóa học, Viện hóa học, Việt Nam.
	Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
	Nguyễn Văn Minh (2010), “Các phương pháp sản xuất tinh dầu”, Bản tin khoa học công nghệ, Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu, (1), 23-30
	Lã Đình Mỡi (2002), Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam, tập II, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
	Nguyễn Đình Triệu (2006), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
	Dairy R. Batish, Harminder pal Singh, Ravinder Kumar Kohli, Shalinder Kaur (2008), “Eucalyptus essential oil as a natural pesticide”, Forest Ecology and Management, (256), 2166-2174.
	European commission (2009), “Eucalyptus essential oil as an alternative to chemistry pesticide”, Science for Environment policy, Special issue 13.
	Filimonov D. A., Poroikov V. V (2006), Prediction of biological activity spectra for organic compounds, Russian Chemical Journal, 50 (2), 66-75.
	H. P. Singh, D. R. Batish , N. Setia R. K. Kohli (2005), “Herbicidal activity of volatile oils from Eucalyptus citriodora against Parthenium hysterophorus”, Annals of Applied Biology, (146, issue 1), 89-94.
	LIU Yu-Qing1 and et (2010), “Toxicity of β-Caryophyllene from Vitex negundo (Lamiales: Verbenaceae) to Aphis gossypii Glover (Homoptera: Aphididae) and its action mechanism”, CNKI journal
	National institute of materia medica Hanoi – Vietnam (2001), Selected medicinal plants in Vietnam, Vol I, Science and technology publishing house, Hanoi.
	Rab. M. A. (1994), “Changes in physical properties of a soil associated with logging of Eucalyptus regnans forest in sountheastern Australia”, Forest Ecology and Management, (70), 215-229.
	Mouhssen Lahlou (2004), “Method to stuty the phytochemistry and Bioactivity of Eucalyptus oil”, Phytotheapy reasearch, (18), 435-448.
	P. A. Morrow and Laurel R. Fox (1980), “Effects of variation in Eucalyptus Essential Oil yeild on insect growth and garazing damage”, Oecologia, (45), 209-219.
	Poroikov V. V., Filimonov D. A., Borodina Yu. V., Lagunin A.A., Kos A. (2000), “Robustness of biological activity spectra predicting by computer program PASS for non-congeneric sets of chemical compounds”, J. Chem. Inform. Comput. Sci., 40 (6), 1349-1355.
16	Soto M., Field J. A., Lettinga G., Méndez R. and Lema J. M. (1991), “Anaerobic biodegradability and toxicity of eucalyptus fiber board manufacturing wastewater”, Journal of Chemical Technology & Biotechnology, (52), 163–176.
17	Sukontason, Boonchu, Choochote (2004), “Effective of Eucalyptol on house fly and blow fly”, Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo, 46 (2), 97-101
18	Yang Y.C., Choi H. C., (2004), “Ovicidal and adulticidal activity of Eucalyptus globulus leaf oil terpenoids against Pediculus humanus capitis”, Agric. Food Chem, (52), 2507-2511.

PHẦN PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1

MỘT SỐ CHẤT CHÍNH TRONG TINH DẦU LÁ BẠCH ĐÀN

TT	Tên thông thường	Tên quốc tế	Công thức phân tử	Công thức cấu tạo	CASS #
	α -pinene	(1S,5S)-2,6,6-Trimethyl bicyclo[3.1.1]hept-2-ene	C10H16		80-56-8
	β-pinene	6,6-dimethyl- 2-methylenebicyclo [3.1.1] heptane	C10H16		127-91-3
	β -cymene	(1S,5S)-2,6,6-Trimethyl bicyclo[3.1.1]hept-2-ene	C10 H14		123-35-3
	eucalyptol (1-8 cineole)	1,3,3-trimethyl- 2-oxabicyclo[2,2,2]octane	C10H18O		470-82-6
	(E)-beta-ocimene	(E)-3,7-Dimethyl-1,3,6-octatriene	C10 H16		3779-61-1
	Linalool	3,7-dimethylocta-1,6-dien-3-ol	C10H18O		78-70-6
	citrolellal	3,7-dimethyloct-6-en-1-al	C10 H18 O		470-82-6
	isopulegol	5-methyl-2-prop-1-en-2-ylcyclohexan-1-ol	C10H18O
	Glyoxime	glyoxal dioxime	C2H4N2O2		557-30-2
	β-citronellol	β-Rhodinol, (S)-3,7-Dimethyl-6-octen-1-ol	C10 H18 O		7540-51-4
	(-)-lavandulol	2-isopropylpentyl-5-methyl-4-hexen-1-ol	C10 H18 O		498-16-8
	β -caryophyllene	4,11,11-trimethyl-8-methylene- bicyclo[7.2.0]undec-4-ene	C15 H24		87-44-5