Tài liệu vi khuẩn Listeria monocytogenes

Tổng quan về vi khuẩn listeria monocytogenes

Trực khuẩn gây bệnh listeria monocytogenes là vi khuẩn gram dương, hiếu kỵ khí tùy tiện, có khả năng di động, vi khuẩn không tiết ra ngoại độc tố nhưng có nội độc tố gây hoại tử. Chúng sinh phát triển ở nhiệt độ 1oC - 45oC, tốt nhất là khoảng 45oC và ở pH: 6-8, do đó nó có thể tồn tại thời gian dài trong môi trường, chúng bị tiêu diệt bằng phương pháp thanh trùng và nấu chín. Nó tồn tại rộng rãi trong tự nhiên đất, phân, động vật, rau hỏng, nước thải, sữa, phô mai và một số thực phẩm đóng hộp từ động vật không đảm bảo vệ sinh. Vi khuẩn listeria có trong nguồn thực phẩm không đảm bảo vệ sinh là một nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm nguy hiểm.

Khả năng gây bệnh của vi khuẩn listeria monocytogenes

Vi khuẩn sau khi xâm nhập vào cơ thể nếu qua đường tiêu hóa: Có thể gây bệnh tại đường tiêu hóa hoặc không chỉ gây bệnh ở đường tiêu hóa mà còn có thể xâm nhập vào máu gây tình trạng nhiễm khuẩn huyết hoặc lây lan sang hệ thần kinh trung ương gây viêm màng não, trường hợp gây bệnh nặng hay gặp ở những người có hệ miễn dịch suy yếu.Ở phụ nữ mang thai mắc bệnh có thể lây truyền sang thai nhi gây sảy thai, thai chết lưu, đẻ non hoặc trẻ sơ sinh bị nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não sau sinh từ 1 đến 4 tuần.Con đường lây bệnh: Vi khuẩn listeria có thể lây qua con đường sau
Qua đường ăn uống: Khi ăn phải thức ăn bị nhiễm vi khuẩn, ngộ độc thực phẩm.Truyền từ mẹ sang con qua nhau thai hay trong quá trình sinh đẻ. Ở những người khỏe mạnh, dù ăn một lượng ít thức ăn có chứa vi khuẩn listeria cũng có thể không nhiễm bệnh, nhưng ở những đối tượng có nguy cơ cao dù một lượng nhỏ vi khuẩn listeria trong thức ăn cũng có thể gây ra bệnh.

Vi khuẩn sau khi xâm nhập vào cơ thể nếu qua đường tiêu hóa

Kiểm nghiệm listeria monocytogenes đáp ứng kiểm soát an toàn thực phẩm

Phương pháp kiểm tra listeria monocytogenes theo truyền thống là phương pháp vàng để kiểm tra chỉ tiêu này. Tuy nhiên, để thực hiện chính xác quy trình kiểm theo TCVN cần phải đáp ứng điều kiện về phòng thí nghiệm và cán bộ vi sinh có tay nghề cao vì trong quá trình kiểm tra phải thao tác nhiều bước như tăng sinh, nuôi cấy, khẳng định sinh hóa, ... . 

Sơ đồ quy trình  theo Tiêu Chuẩn Quốc Gia _TCVN 7700-1 : 2007_ISO 11290-1 : 1996

Các phương pháp mới giúp kiểm tra nhanh hơn, thao tác đơn giản hơn và an toàn hơn đang dần thay thế các phương pháp truyền thống do những ưu điểm của nó. Hãng 3M- Mỹ một trong những thương hiệu tiên phong trong việc ứng dụng những công nghệ tiên tiến vào việc kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm, đã nghiên cứu thành công hệ thống kiểm tra nhanh các vi sinh vật gây bệnh như Salmonella, Listeria spp, Listeria monocytogenes, E. coli O157, Campylobacter , Cronobacter  và độ tố STEC - 3M Molecular Detection System trong nhiều loại thực phẩm và môi trường. 

Nguyên lý của 3M Molecular Detection System dựa vào công nghệ LAMP là sự kết hợp giữa khuếch đại phân tử DNA đẳng nhiệt và phát quang sinh học cho kết quả nhanh nhất 24-27 giờ.

Quy trình thực hiện 3 bước đơn giản

Kit MDS kiểm Listeria monocytogenes 3M™

Hãng: 3M- Mỹ

Code: MDA2LMO96

Quy cách: 96 test/hộp

Kit MDS kiểm Listeria monocytogenes 3M™

• Bộ Kit MDS này phương pháp đơn giản, ít thao tác giúp hạn chế được các sai số do nhân viên
• Hóa chất, thuốc thử đã được pha sẵn có thể sử dụng ngay
• Các ống nghiệm đã được phân biệt bằng màu sắc để dễ dàng nhận diện. Có thể chạy đồng thời 96 mẫu giúp tăng năng suất công việc.
• Kết quả nhanh chóng trong vòng 24-27 giờ, giúp đưa ra những phương án sản xuất, khác phục nhanh hơn.
• Là phương pháp đáng tin cây, đạt tiêu chuẩn AOAC

Xem thêm các chỉ tiêu khác tại đây>>>

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINHBỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌCKiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩmPhương pháp xác định L.monocytogenesGiáo viên hướng dẫnThS. NGUYỄN TIẾN DŨNGSinh viên thực hiệnPHẠM THÀNH THÁIPHẠM MINH DUYNGUYỄN THANH MINHPhương pháp xác định L.monocytogenesI/ GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LISTERIA MONOCYTOGENESKingdom: BacteriaDivision: FirmicutesClass: BacilliOrder: BacillalesFamily: ListeriaceaeGenus: ListeriaSpecies: Listeria monocytogenesI.1.̶ĐẶC ĐIỂMListeria monocytogenes là vi khuẩn Gram +, không bàotử, yếm khí và có thể phát triển trong điều kiện lạnh 2-4 oC, nhiệtđộ tối ưu là 35-37oC.̶Khuẩn lạc tròn đều, màu nâu đen hoặc xanh đen. Đườngkính: 2-3 mm và môi trường xung quanh khuẩn lạc có màu đenvới trung tâm khuẩn lạc lõm xuống. Đây là đặc điểm đặc trưngcủa giống Listeria.̶Listeria không chứa độc tố, gây bệnh bằng lượng tế bào sốngxâm nhiễm vào vật chủ.̶Trong số bảy loại Listeria được biết đến, chỉ cóL.monocytogenes mới là tác nhân thật sự của những ca nhiễm khuẩntừ thực phẩm (infection alimentaire). Có tất cả 11 chủng huyếtthanh (sérotypes) trong đó 90% trường hợp bệnh Listériosis ở ngườiđều do các serotype 1a, 1b và 4b gây nên. Trong ba nhóm vừa kể,thì 4b là serotype độc hại nhất.1Phương pháp xác định L.monocytogenesI.2.̶TÁC HẠIL. monocytogenes là nguyên nhân gây ra một loại bệnh nguy hiểm lây nhiễm thực phẩmmang tên listeriosis. Triệu chứng đầu tiên thường là tác động đối với hệ thống đường ruột, gây rabuồn nôn, nôn và tiêu chảy. Gây viêm não và viêm màng não, nhiễm khuẩn máu và đôi khi cóthể gây áp xe não. Thời gian phát bệnh thường là hơn 12 giờ sau khi nhiễm L. monocytogenes.Bệnh có thể kéo dài từ ba ngày đến ba tuần.̶Sự biểu hiện không thường xuyên khác của listeriosis đối với người còn là viêm màngtim gây thương tổn tim, nhiễm trùng gây viêm khớp, viêm tuỷ xương, nhiễm trùng màng phổi vàviêm màng bụng.̶Với phụ nữ đang mang thai, có thể gây xảy thai, sinh non, hoặc thai chết lưu.I.3.̶PHÂN BỐVi khuẩn L.monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh.Chúng được thấy trong đất cát, trong nước, trong phân thú vật vàcả trong phân người.̶Thừơng xuất hiện trong các loại thực phẩm như: Sữa tươikhông được hấp khử trùng , thịt gà, cua và thịt nguội , phomat,xúc xich, rau,…̶Thú vật có thể chứa vi khuẩn nhưng không bị bệnh.Chúng có thể lây nhiễm vào tất cả thực phẩm như thịt, sữa, fromage, thịt nguội và đồ biển.̶Vi khuẩn có thể nhiễm vào chúng ta qua các vật dụng nhà bếp như dao, thớt bẩn hoặc từtay đã bị nhiễm trùng.̶Chúng ta cũng có thể bị nhiễm khuẩn L.monocytogenes nếu có sự tiếp xúc trực tiếp vớithú có mang vi khuẩn này.2Phương pháp xác định L.monocytogenesII.Giới thiệu về các phương pháp phân tíchII.1. Chuẩn bị mẫu̶ Hầu hết các phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng phân tử đều yêu cầu việc chuẩn bị vàxử lý mẫu trước khi thực hiện. Các bước này bao gồm pha mẫu, cô đặc vi sinh vật, tiền tăng sinhvà tách chiết DNA.̶ Pha mẫu lấy vi sinh vật có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp: rửa, phun xịt,khuấy bằng sóng âm hay xoáy nước (sử dụng cho mẫu dụng cụ như bàn, chai lọ…), khuấy bằngcánh khuấy (blender), stomacher và pulsifier.̶ Cô đặc có thể được thực hiện với ly tâm, lọc qua màng, dielectrophoresis hoặc phươngpháp miễn dịch từ tính.̶ Đối với xét nghiệm Listeria trong thực phẩm, bước tiền tăng sinh thường được thực hiệnbằng cách tăng sinh bước một trên môi trường không chọn lọc trong 4 giờ, sau đó tăng sinh chọnlọc trên môi trường Buffered Listeria Enrichment Broth Base (BLEB) trong 4 giờ ở 30oC, sau đóbổ sung thành phần chọn lọc và nuôi cấy tiếp 20-44 giờ nữa.Môi trường BLEB:Formula / LiterEnzymatic Digest of Casein....................................................17 gEnzymatic Digest of Soybean Meal..........................................3 gYeast Extract..............................................................................6gDextrose.................................................................................2.5 gSodium Chloride.......................................................................5 gMonpotassium Phosphate....................................................1.35 gDipotassium Phosphate.........................................................2.5 gDisodium Phosphate..............................................................9.6 gFinal pH: 7.3 ± 0.2 at 25°CBLEB Base Supplements/225mLAcriflavine HCl, 0.5%Nalidixic Acid, 0.5%Cycloheximide, 1.0%̶ Tách chiết DNA có thể được thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau: sử dụng dungdịch đệm enzyme, nhiệt hoặc phá tế bào bằng các hạt kim loại.̶ Quy trình tách chiết DNA của L. monocytogenes bằng enzyme có thể được thực hiện nhưsau: Sau khi tăng sinh, 400 μl broth được trộn với 800 μl dung dịch đệm ly giải (0.5% Nlaurylsarcosine, 50 mM Tris-Cl, 25 mM EDTA; pH 8.0). Hỗn hợp được ly tâm ở 20800 x g trong3Phương pháp xác định L.monocytogenes5 phút. Phần lắng được trộn với 400 μl dung dịch ly giải chứa glycogen (0,03 μg/μl). 1 μlproteinase K (20 mg/ml) được thêm vào, và dung dịch được ủ trong 1 giờ ở 37oC. Sau khi ủ, 600μl của một dung dịch NaI (6 M NaI trong 50 mMTris-Cl-25 mM EDTA [ph 8.0]) và 1 mlisopropanol được thêm vào, và hỗn hợp được ly tâm ở 20800 x g trong 5 phút. Phần lắng đượcrửa với isopropanol 35%, làm khô trong thời gian ngắn và hòa tan lại vào 50 μl nước cất.II.2. Các phương pháp không nhân bảnXác định tỉ lệ G+C:̶ Tỉ lệ G+C trong bộ gen của vi khuẩn trải dài từ 20% đến 80% và có khuynh hướng khôngthay đổi giữa các loài họ hàng gần, cũng như ít bị ảnh hưởng do tái sắp xếp nhiễm sắc thể, mấtgen hay lặp gen. Ví dụ như tỉ lệ G+C của họ Listeria vào khoảng 37% trong khi E.coli vàokhoảng 50%. Do đó có thể dựa vào tỉ lệ G+C của bộ gen để xác định sơ bộ loài vi sinh vật.̶ Một phương nhanh chóng và thuận tiện để xác định tỉ lệ G+C là bằng cách đo nhiệt độnóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Tỉ lệ G+C trong DNA ảnh hưởng nhiều đến nhiệt độ nóngchảy của mạch đôi (hình 1b). Mandel và cộng sự (1970) đã lập ra công thức tính toán tỉ lệ G+Ctheo Tm dựa vào một DNA chuẩn:mol% (G+C)x = mol% (G+C)r + 1,99(Tmx - Tmr)trong đó x là DNA chưa biết, còn r là một DNA chuẩn, thường lấy E. coli dòng B với tỉ lệ G+Cđược tính là 50-51 mol%. Tuy nhiên công thức trên không chính xác cho các DNA có tỉ lệ G+Cquá thấp hoặc quá cao.̶Người ta có thể đo Tm đơn giản bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nmvới một máy quang phổ kế (hình 1a), hoặc đo với màu huỳnh quang SYBR Green.Hình 1:a – Độ hấp thụ ở bước sóng 260nm theo nhiệt độ nóng chảyb – Phần trăm cặp G+C theo nhiệt độ nóng chảy4Phương pháp xác định L.monocytogenesLai DNA-DNA:̶Trong protocol lai DNA-DNA truyền thống, DNA từ một dòng chuẩn được cắt bằng sóngâm và trộn với DNA của dòng cần kiểm tra đã được cắt và đánh dấu phóng xạ. Hỗn hợp đượcđun nóng 100oC từ 3-4 phút và giữ ở 60 hoặc 75oC trong 16 giờ. Sau khi loại bỏ các đoạn DNAmạch đơn không gắn bằng một cột hydroxyapatite, các đoạn DNA mạch đôi đã gắn được thu lại,từ đó mức độ lai có thể được xác định bằng cách đo lượng phóng xạ còn lại. Trong các protocolsau này, enzyme, biotin, và SYBR green được dùng thay cho đồng vị phóng xạ. Tuy nhiên, vìphương pháp này yêu cầu kỹ thuật cao và giá trị liên kết của DNA không luôn luôn thể hiện nhậndạng trình tự thật sự hoặc mức khác biệt trong bộ gen, nên ít được dùng trong các ứng dụng xétnghiệm thường xuyên.Lai gen probe:̶ Gen probe là một đoạn nucleic acid mạch đơn ngắn đặc hiệu được đánh dấu với enzyme,màu huỳnh quang, biotin hoặc đồng vị phóng xạ và được sử dụng để phát hiện các trình tựnucleic acid mục tiêu bổ sung với nó được gắn trên một bề mặt rắn (thường là gen ListeriolysinO hoặc msp). Để thực hiện lai gen probe, vi sinh vật cần kiểm tra trước tiên phải được tăng sinhvà phân lập từ dòng thuần và gắn lên một ma trận cơ chất (ví dụ như màng nitrocellulose, màngnylon, hoặc đĩa microtiter) rồi được ly giải để giải phóng DNA gắn lên cơ chất. Sau đó nó đượclai với một probe có đánh dấu đặc hiệu cho Listeria (có thể là một đoạn gen được cắt ra từ DNAcủa Listeria hoặc tổng hợp từ 16S và 23S rRNA hoặc những yếu tố di truyền khác). Các đoạnkhông gắn được rửa đi và những đoạn lai còn lại được phát hiện với một lượng cơ chất thích hợphoặc chụp hình phóng xạ. Nếu mức độ màu hoặc phóng xạ cao hơn mức độ tương ứng của mẫuđối chứng âm chứng tỏ có Listeria hiện diện trong mẫu. Vì quy trình này thực hiện được với cácloài Listeria khác nhau ở mức độ di truyền, nó chắc chắn là đặc hiệu hơn phương pháp dựa trênkiểu hình.̶ Một số probe cho Listeria đã được thương mại hóa, bao gồm Accuprobe (Gen-Probe Inc.,San Diego, California) tập trung vào mRNA của gen gây bệnh; GeneTrak DNA hybridization kit(Neogen Corporation, Lansing, Michigan), dùng probe đánh dấu peroxidase của cây horseradishphát hiện bằng máy đo màu; và công nghệ phát hiện vermicon (VITｮ, Munich, Germany), pháthiện RNA trong tế bào với probe oligonucleotide đánh dấu huỳnh quang. Tuy nhiên, vì lai genprobe không bao hàm việc khuếch đại nucleic acid, nó thường cho độ nhạy giới hạn (cần ít nhất104 bản sao gen mục tiêu trên microliter để phát hiện nếu không khuếch đại tín hiệu và cải thiệnđến 500 bản sao gen mục tiêu trên microliter với khuếch đại tín hiệu), điều này không thích hợpvới việc phát hiện trực tiếp L. monocytogenes từ các mẫu bệnh phẩm/ thực phẩm. Công nghệkhuếch đại nucleic acid vì thế đã làm giảm đáng kể mối quan tâm tới hệ thống lai gen probetrong xét nghiệm Listeria thường xuyên.5Phương pháp xác định L.monocytogenesSouthern Blot:̶ Biến đổi từ lai gen probe, Southern blot nhận diện và xác định vị trí các trình tự DNA bổsung với gen probe được phân tách bởi điện di trên gel agarose. Trong quy trình này, DNA trướctiên được cắt với enzyme cắt giới hạn thành các phần nhỏ với kích thước khác nhau rồi đượcphân tách bằng điện di trên agarose gel. Bản gel chứa các đoạn DNA đã phân tách được xử lývới kiềm (ví dụ NAOH) để chuyển DNA mạch đôi thành mạch đơn, làm DNA dễ bám trên mànghơn và lai được với gen probe. DNA biến tính sau đó được chuyển (blot) từ bản gel lên màng laibằng mao dẫn, và màng chứa các đoạn DNA được nướng (trong trường hợp màng nitrocellulose)hoặc chiếu tia cực tím (màng nylon) để gắn DNA vào màng. Màng sau đó được đem lai vớiprobe DNA hoặc RNA, được gắn với màu huỳnh quang, chất sinh màu hoặc đồng vị phóng xạ.Sau khi rửa đi các probe dư, các phần lai có thể nhận thấy được bằng màu trên màng hoặc bằngchụp phóng xạ với phim x-ray. Southern blot đã được dùng trong nhiều nghiên cứu phân loại loàiListeria, xác định serotype dòng 4b và subgroup IIIA, IIIB và IIIC của L. monocytogenesI.II.3. II.3. Phương pháp PCR̶ PCR là một phương pháp đượcchứng minh là có độ nhạy cao, chỉ cầnkhoảng 10x10-12 g DNA là có thể thu nhậnkết quả trên gel agarose. Do đó PCR đượccoi là phương pháp có độ nhạy cao để xácđịnh bacteria trong đó có Lesteria. Một vàiphương pháp kiểm tra bằng PCR đượcthương mại như BAX® PCR system(Qualicon, Wilmington, Delaware), Probelieassay (Sanofi Diagnostic Pasteur, Marne laCoquette, France), LightCycler foodproof(Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana)và Warnex L.mono Assey (Warnex Inc.,Laval, Quecbec, Canada).̶ Tuy nhiên, cho dù đây có là một công cụ mạnh mẽ nhưng không có nghĩa là PCR khôngcó những khuyết điểm. Một khuyết điểm đầu tiên là phản ứng PCR có thể bị nhiễm dẫn đến kếtquả dương tính giả. Một cách thức để loại bỏ sự tạp nhiễm là sử dụng dUTP thay vì dTTP, saukhi phản ứng PCR thì U-DNA (uracil-containing DNA) có thể được loại bỏ bằng enzyme uracilDNA-gycosylase; sau đó có thể kiểm tra mẫu tiếp theo.6Phương pháp xác định L.monocytogenesNested PCR̶ Đây là một biến thể của PCRthường, Nested PCR sử dụng hai cặpprimer oligonucleotide trong phản ứngriêng rẽ, làm tăng độ nhạy và tínhchuyên biệt, là hướng giải quyết choviệc chỉ có một lượng mẫu nhỏ. Sauquy trình đầu nhân bản DNA trong 1530 chu trình với 1 cặp primer, sảnphẩm sau đó được chuyển vào mộtống mới cho việc nhân bản lần 2 vớicặp primer khác, có trình tự ở trongsản phẩm của phản ứng 1. Do đóNested PCR thì chuyên biệt và nhạyhơn so với PCR thông thường. Một vídụ để thấy rõ vấn đề này là: sử dụngPrimer từ vùng 16S rRNA ở giai đoạnthứ nhất, và những vùng chuyên biệtcho từng loài, chủng ở giai đoạn thứhai; Nested PCR có thể xác định ởmức độ 4x10-15 g DNA/phản ứng dođó có thể nhận biết đoạn gene đặc trưng của L.monocytogenes. Phương pháp này có thể xác địnhtới khoảng 10 tế bào. Tuy nhiên, ngoài việc tốn một khoảng thời gian cho quá trình nhân bản lầnhai thì Nested PCR cần phải đảm bảo việc vô trùng trong quá trình chuyển sản phẩm từ quá trìnhmột sang ống hai để thực hiện chu trình hai.Multiplex PCR.̶Một biến thể khác của PCR, Multiplex PCR đơn giản là sử dụng 2 hoặc nhiều cặp primercho những mục tiêu khác nhau trong cùng một phản ứng, kết quả là nhân bản nhiều đoạn genetrong cùng thời gian. Nên nó cho phép phát hiện nhiều mầm bệnh của cùng một loài. Sản phẩmcủa Multiplex PCR sẽ được phân tách ra bằng điện di trên gel agarose. Tuy nhiên đối với nhữngsản phẩm có kích thước tương đương nhau thì không thấy rõ sự khác biệt. Với việc sử dụngnhững loại thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau cho mỗi cặp primer thì việc nhận biết sản phẩmcủa Multiplex PCR sẽ thuận tiện hơn, nó giống như là real-time. Ví dụ dùng primer bổ sung vớivùng bảo toàn cao ở Listeria là 23S rRNA và L.monocytogenes hly gene, cả Listeria vàL.moncytogenes đều có thể được nhận biết cùng lúc thông qua real-time PCR.̶ Trong một phiên bản chi tiết hóa của Multiplex PCR, universal primer thu nhận từProkaryotic 23S rRNA được đánh dấu với biotin. Sản phẩm PCR được làm biến tính và sau đó7Phương pháp xác định L.monocytogenestrộn lẫn với những quả cầu nhỏ (microphere) đã được đánh dấu huỳnh quang, mỗi mộtoligonucleotide đặc trưng cho một bệnh (pathogen-specific) thì sẽ có vạch quang phổ khác nhau.Sau khi thêm vào streptavidin-R-phycoerythrin, chất gây tác động đến biotin trong quá trìnhnhân bản DNA và trong bước sóng khác nhau của các microphere, và trong quá trình phân biệtcác mảnh DNA chứa nguồn bệnh khác nhau. Việc ứng dụng Multiplex PCR cho đoạn gene iapcó thể phân biệt cả 6 loài Lesteria chỉ trong một kiểm nghiệm. Tuy nhiên vấn đề thêm vào nhiềuprimer trong một ống thì cần phải thiết kế cẩn thận và tối ưu hóa các điều kiện như nhiệt độ ủ,…Reverse transcription PCR (RT-PCR)̶Đầu tiên là tạo cDNA từ mRNA, sau đó cDNA được nhân bản lên trong phản ứng PCR.Cả hai quá trình có thể thực hiện bởi một enzyme là Tth DNA polymerase, đóng vai trò làreverse transcriptase và DNA polymerase. RT-PCR là một kỹ thuật có độ nhạy cao khi chỉ cầnmột lượng nhỏ mRNA là có thể nhân bản và nhận biết. Sự có mặt của trình tự mRA đặc biệt thìcó thể chỉ ra được khả năng của tế bào, mRNA bị phân hủy rất nhanh (trong khoảng 1-20 phút)ngay sau khi tế bào tế ; DNA thì vững bền sau nhiều năm, phụ thuộc vào điều kiện lưu giữ. Thựcvậy, RT-PCR nhân bản của mRNA từ L.monocytogenes Scott A tổn thương bởi nhiệt đã đượcđược sử dụng nhiều hơn là dùng PCR trực tiếp để tránh dương tính giả bởi những tế bào chết.Real-time PCR̶ Là phương pháp cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm PCR ngay khi phản ứngđang xảy ra. Việc này thực hiện được nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnhquang, mà sự gia tăng lượng DNA sẽ làm gia tăng lượng huỳnh quang phát ra.Quantitative PCR (Q-PCR : PCR định lượng)̶ Đây là công cụ bắt buộc trong chuẩn đoán nguồn bệnh, những biến thể của PCR thìkhông thực sự hiệu quả trong việc xác định chính xác nguồn bệnh trong mẫu. Q-PCR là một thiếtkế đặc biệt để thực hiện việc này, hiện nay có ba phương pháp phát hiện dựa trên Q-PCR : phântích dựa trên điện di gel agarose, gồm cả thuốc nhuộm SYBR green, và sử dụng probe có pháthuỳnh quang. Mặc dù phát hiện sản phẩm Q-PCR bằng điện di trên gel agarose thì tiết kiệm,dùng SYBR green hay probe gắn huỳnh quang trong real-time Q-PCR thì ngày càng được sửdụng nhiều hơn bởi chúng có độ nhạy cao.̶ Nhiều phiên bản của Q-PCR (như 5’ nuclease PCR hoặc sự thay đổi huỳnh quang(fluorescent resonance energy transfer) [FRET]-based Q-PCR) dựa vào đặc tính endogenous 5’ 3’ nuclease của DNA polymerase chịu nhiệt (như Taq, Tth và Tfl DNA polymerase) để tạo ra8Phương pháp xác định L.monocytogenesnhững dấu hiệu định lượng bằng sự thủy phân dual-fluorophore-labeled oligonucleotide probetrong quá trình nhân bản. Các probe gắn với các chất phát huỳnh quang và hấp thụ huỳnh quang,và được thêm trực tiếp vào phản ứng PCR. Fluorogenic reporter probe được phóng thích bởiDNA polymerase, như vậy đây sẽ là dấu hiệu để định lượng mẫu. Fluorogenic 5’ nuclease PCRđã được sử dụng thành công trong việc phát hiện L.monocytogenes với trình tự mục tiêu là DNAhay RNA. Như vậy hệ thống Q-PCR thì có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiệnL.monocytogenes với giới hạn phát hiện là 104 CFU.ml-1 sau 35 chu kỳ và 102 CFU.ml-1 sau 45chu kỳ.Phương pháp 5’ nuclease reverse transcriptase (RT) PCR trong xác địnhListeria monocytogenes.Phương pháp 5’ nuclease được phát triển để phát hiện L.monocytogenes. Mục tiêu của phươngpháp này là Hemolysin A (hlyA), phần chỉ được tìm thấy trong L.monocytogenes.Trong quá trình chế biến thì Listeria monocytogenes bị giết một phần bởi nhiệt, nhưng qua việcbảo quản thì L.monocytogene có thể xâm nhiễm/tái sinh trở lại. Nhằm bảo đảm an toàn chongười sử dụng thì cần phải kiểm tra xem có hay không L.monocytogenes trong sản phẩm. Việckiểm tra cần phải nhanh chóng và chính xác nhằm đảm bảo sản phẩm vẫn giữ được hương vị khiđến tay người sử dụng. Phương pháp fluorogenic 5’ nuclease PCR trong phân tích real-time RTPCR nhằm phát hiện mRNA, do mRNA chỉ xuất hiện xuất hiện trong những tế bào sống. Trongphương pháp này chúng ta kết hợp giữa 5’ nuclease RT-PCR với nuôi cấy kị khí trong PSU(Penn State University) nhằm phát hiện L.monocytogenes.Materials and MethodsBacterial strains and culture conditions.L.monocytogenes Scott A (NADC 2045) được bảo quản (4°C) trong tryptic soy agar bổ sung0,6% yeast extract (TSAYE; Difco Laboratories, Detroit, MI), trên thạch nghiêng và được cấytruyền hàng tháng. Để xâm nhiễm vào lợn, L.monocytogenes Scott A được sinh trưởng (37°C,18h ở 150rpm) ở tryptic soy broth bổ sung 0,6% yeast extract (TSBYE; Difco Laboratories). Quátrình gây nhiễm nhân tạo ở lơn, 1ml culture (~109 CFU) được ly tâm (5000X g trong 10 phút),giọt nhỏ (pellet) được cho vào 10ml nước peptone 0,1%, lượng tế bào ở ~ 108 CFU/ml.9Phương pháp xác định L.monocytogenesHeat treatment of L.monocytogenes in Ground Pork.Ground pork mua ở siêu thị (40kGy) tại Iowa State University Irradiation Facility (Ames, IA).Hai thí nghiệm được tiến hành trong những ngày khác nhau với cùng một mẫu ground pork.Ground pork (~10g) được khử trùng để sau đó thêm vào 0,1ml L.monocytogenes (~107 CFU/ml),như vậy sẽ đạt 106 CFU/g. Tất cả các phần được trộn lẫn để chia đều cho xâm nhiễm và cô đặclại dày khoảng 2-3mm trước khi đóng gói chân không (vacuum packaging) (model A300/51;Multivac, Wolfertschwenden/Allgau, Germany). Mẫu được dìm xuống dòng nước tuần hoàn(circulating waterbath) (60C, Lindberg/Blue M, model 91, Asheville, NC). Sau khi cân bằng (~1phút tới 60°C), những gói thịt sẽ được lấy khỏi ở những thời điểm khác nhau (0, 2, 4, 6, 8, 10,12, 13, 14 phút) và đặt ngay vào nước lạnh (0°C). Sau khi làm lạnh, mỗi mẫu sẽ kết hợp với90ml peptone 0,1% (1 phút ở tốc độ trung bình; Seward Labblender 80, Seward Ltd., London,England).Tăng sinhNhững tế bào sống sót sau xử lý nhiệt sẽ được điếm bằng cách trải mỏng bã thịt (~1ml) trên agarchọn lọc Modified Oxford (MOX) nuôi cấy hiếm khí cũng như trên TSAYE được nuôi cấy kị khíhay hiếm khí. Lượng xác định (~1ml) của bã thịt được chuyển đến PSU (19ml) nhân giống ở37°C. Ở 24, 48 và 72h, với những độ pha loãng khác nhau của MOX hay TSAYE.RNA isolationNhững tế bào L.monocytogenes Scott A bị tổn thương bởi nhiệt đã phục hồi trong PSU broth(37°C, 48h) được thu từ ~5ml PSU, giọt nhỏ (pelleted) (5000 x g, 10 phút ở 4°C) (SorvallHeraeus RC 5°C plus centrifuge; Kendro Laboratory Products, Newtown, Ct), và rửa 2 lần trong10ml nước peptone 0,1%. Hai biện pháp được đánh giá trong việc tách RNA L.monocytogenes.Ở phương pháp 1, những khối tế bào được ngưng kết trong 100 μl TE (10 mM Tris-HCl [pH8.0], 1mM EDTA [pH 8.0]) chứa lysozyme (3mg/ml), ủ (15 phút, 37°C) và hỗn hợp đượcchuyển sang ống tube microfuge 1.5ml vô trùng. RNA tổng số được chuẩn bị để sử dụng Rneasymini-kit (QIAGEN, Valencia, CA). Trong phương pháp 2, RNA được ly trích dùng phương pháptẩy rửa 3 lần (three-detergent), phương pháp này làm tế bào phân giải dựa trên sự kết hợp SDS,Tween 20 và Triton X-100 (SST). Genomic DNA giảm đi bằng việc khử purin và buffer phenolđược sử dụng để giảm lượng protein. Sản phẩm trong cả hai phương pháp đều được ủ (30 phút ở37°C) với RQ1 Dnase (Nồng độ cuối (Final concentration) 10 U/ml; Promega, Madison, WI)trước khi sử dụng cho phương pháp RT-5’ nuclease PCR.10Phương pháp xác định L.monocytogenesRT-5’ nuclease PCR assay.cDNA được tạo ra khi sử dụng random hexamer primer kit (GeneAmp EZ rTth RNA PCR kit,Applied Biosystems, Union City, CA). Mỗi 50 μl phản ứng có 1x EZ buffer, 3.0 mM manganeseacetate, 0.3 mM mỗi dATP, dCTP, dGTP, d TTP; 0.45 μM mỗi primer, 26 mM probeHLYAP15, 10U rTth DNA polymerase và 5 μl mẫu. Nhân bản trong máy ABI PRISM 7700Sequence Detection System (Applied Biosystems). Mẫu được giữ ở bước reverse transcription(60°C, 30 phút). Sau đó chu trình nhân bản bắt đầu ở 95°C trong 2 phút tiếp theo là 40 chu kỳbao gồm biến tính (95°C trong 15s), gắn mồi (60°C trong 30s) và kéo dài (72°C trong 90s). bướccuối cùng là 72°C trong 10 phút và sau đó giữ ổn định ở 4°C.Vị trí của các primer trên vùng hlyA mRNA L.monocytogenesResults̶ Nấu thịt lợn, bị nhiễm nhân tạo L.monocytogenes Scott A (~6.105 CFU/g), ở 60°C trong14 phút, xử lý nhiệt với 100% tế bào, đã chứng tỏ bằng không có colonies trong ager chọn lọcMOX và phát triển giảm khi ủ trong agar không chọn lọc TSAYE ở hiếm khí (~5 x 10) hoặc kịkhí (~2 ).11Phương pháp xác định L.monocytogenes̶ Ở hình 1, tế bào bị tổn thương bởinhiệt đã phục hồi sau 47h trên PSU brothbổ sung 7g/l LiCl, cho thấy rằng pháttriển trên MOX agar cũng như TSAYE ủhiếm khí (~2 x 106 CFU/ml) hoặc kị khí(1,8 x 105 CFU/ml). Nhưng lại không cócolony phát triển trên MOX (100% tổnthương),sựpháttriểncủaL.monocytogenes trong PSU broth tăngsau 24 (~1.3 x 103), 48 (105) và 72 (5 x108) h.̶ Sau khi phục hồi trên PSU broth (37°C, 48h) L.monocytogenes được phát hiện bởi RT-5’nuclease PCR dùng hai phương pháp phân lập RNA. Ở phương pháp thứ nhất, tín hiệu huỳnhquang xuất hiện sau 14 chu kỳ (CT = 14) với giá trị ΔRn là 3.24. Trong phương pháp 2 thì tínhiệu huỳnh quang xuất hiện trễ hơn sau 24 chu kỳ (CT = 24) với giá trị ΔRn thấp hơn là 1.62.12Phương pháp xác định L.monocytogenesPhụ lục13Phương pháp xác định L.monocytogenes14Phương pháp xác định L.monocytogenes15Phương pháp xác định L.monocytogenes16Phương pháp xác định L.monocytogenes17