Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hoặc một chất đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: - Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography): pha tĩnh là một chất rắn có khả năng hấp phụ. - Sắc ký phân bố (partition chromatography): pha tĩnh là chất lỏng không hòa lẫn được với pha động, chất lỏng này được bao trên bề mặt của một chất rắn gọi là giá hay chất mang và phải là chất trơ, không tham gia vào sắc ký. - Sắc ký ion (ion-exchange chromatography): pha tĩnh là chất nhựa trao đổi ion, là hợp chất cao phân tử có mang những ion có khả năng trao đổi ion với các ion cùng dấu của dung dịch hỗn hợp sắc ký. - Sắc ký rây phân tử (size – exclusion chromatography): còn gọi là sắc ký lọc gel, phân tách các phân tử dựa trên kích thước của chúng, các phân tử nhỏ hơn sẽ di chuyển chậm hơn, ra khỏi cột lâu hơn, các phân tử có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và ra khỏi cột sớm hơn. Trong đó, sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000). Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: - Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). - Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography) Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau: - Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích. - Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi. Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này. 2. Cấu tạo chung của cột sắc ký Cột sắc ký là ống nhồi chất hấp phụ pha tĩnh nơi xảy ra sự tiếp xúc với mẫu trong dung môi pha động. Các thành phần khác nhau của mẫu tương tác với chất hấp phụ trên pha tĩnh với các lực khác nhau, dẫn tới thời gian ra khỏi cột khác nhau.  Cột sắc ký được cấu tạo bởi 3 thành phần:
Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8 µmol SiOH/m2 bề mặt): Hình 1. Bề mặt silica đã thủy phân Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào Hình 2: Tạo nhánh trên bề mặt silica Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4µmol/m2 bề mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể. Ngoài nhóm Cl người ta còn sử dụng –OCH3. Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh. 3. Phân loại cột sắc ký Hiện nay trên thị trường có khoảng 80.000 cột HPLC từ hơn 30 nhà sản xuất khác nhau như Aligent Technologies, Grace, Merck Millipore, Thermo Scientific, Water… Có nhiều cách khác nhau để phân loại cột, tuy nhiên cách phân loại rộng rãi nhất được chấp nhận hiện nay là theo hệ thống USP (Dược Điển Mỹ), bao gồm: - USP “L”: các loại cột được phân loại dựa trên vật liệu làm đầy - USP “G”: các loại cột dùng cho sắc ký khí - USP “S”: các loại cột hỗ trợ Theo đó, có khoảng 51 loại cột dùng cho sắc ký khí, khoảng 120 loại cột dùng trong sắc ký lỏng chứa các vật liệu làm đầy khác nhau và khoảng 19 loại cột hỗ trợ cho quá trình phân tích các chất bằng sắc ký. Các nhà sản xuất cột phân tích sắc ký hiện nay, ngoài việc đưa ra các thông số của cột, đều đi kèm số tiêu chuẩn tham chiếu theo USP để người phân tích có thể lựa chọn một cách dễ dàng. Ví dụ: một cột với tiêu chuẩn USP L1 tương ứng với cột pha đảo trong đó pha tĩnh là octadecylsilane liên kết hóa học với các hạt silica xốp, hoặc các hạt vi gốm, đường kính 1,5 đến 10 µm hoặc một thanh nguyên khối. Để tạo thuận lợi cho việc lựa chọn cột sắc ký, USP cung cấp một bộ công cụ lựa chọn cột theo tiêu chuẩn USP, theo đó, mỗi một tiêu chuẩn đều đưa kèm theo một danh mục các cột thương mại và nhà sản xuất để các nhà phân tích có thể lựa chọn cột phù hợp. Để tra cứu thông tin, truy cập theo đường link sau: https://www.usp.org/resources/chromatographic-columns Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, dựa theo cơ chế phân tách các chất, cột cũng được chia thành 4 nhóm chính: cột sắc ký hấp phụ, cột sắc ký phân bố, cột sắc ký trao đổi ion, cột sắc ký rây phân tử và một số loại cột chuyên dụng khác. TT Loại cột sắc ký Đặc điểm và ứng dụng 1 Cột sắc ký hấp phụ - Pha tĩnh thường là chất rắn có khả năng hấp phụ, thường là hợp chất vô cơ phân cực như SiO2, Al2O3 hay chất không phân cực như than hoạt tính. - Ứng dụng: dùng phân tích những hợp chất hữu cơ chủ yếu tan trong dung môi, ít tan trong nước, hấp phụ tốt những sản phẩm dầu mỏ, các axít béo và este của chúng, các amin thơm và các hợp chất hữu cơ khác. 2 Cột sắc ký phân bố Chia 2 loại: cột pha đảo và cột pha thường - Cột pha đảo: + Pha tĩnh hầu như không phân cực hoặc ít phân cực do được gắn thêm các nhánh hydrocarbon dài lên bề mặt chất nhồi. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) hay còn gọi là ODS (octadecylsilan), hoặc các nhóm ankyl ngắn hơn như C2, C4. Ngoài ra còn có các cyclohexyl, phenyl trong đó phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm ankyl. + Ứng dụng: được dung để phân tích những hợp chất từ ít phân cực đến phân cực trung bình, các amino acid, carbonhydrate, steroid, chất béo, các axít béo, các nucleic acid, nucleotide… - Cột pha thường: + Pha tĩnh là cột silica xốp chưa qua xử lý hóa học, vẫn còn 100% nhóm chức silanol (cột SIL), hoặc cột chứa silica biến tính hóa học, gắn trên bề mặt các nhóm chức phân cực như aminopropyl (cột NH2) hoặc –cyanopropyl (cột CN), có ái lực cao với các hợp chất phân cực. - Ứng dụng: dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không quá lớn, các đồng phân của hợp chất tocopherol hoặc các hợp chất đường. 3 Cột sắc ký ion - Pha tĩnh là vật liệu trao đổi ion chứa trong cột thủy tinh thường là chất trơ, không tan trong nước. Vật liệu trao đổi ion được sử dụng nhiều nhất là các ionit hữu cơ tổng hợp chứa nhựa trao đổi ion. Các chất trao đổi ion có giá thể là cellulose, sephadex, molselect thường dùng để tách protein. Các chất trao đổi ion có giá thể là polystirol thường dùng để tách chiết peptide có trọng lượng phân tử nhỏ. - Bao gồm: + Cột trao đổi anion (nhựa tích điện dương): nhóm hoạt động R+ thường là nhóm amin, do vậy mang tính bazơ + Cột trao đổi cation (nhựa tích điện âm): nhóm chức hoạt động R-, có thể là nhóm sunfonate, phosphate, cacbonxylate.. 4 Cột sắc ký rây phân tử - Pha tĩnh thường là các hạt silica hoặc polysaccharide hoặc polystyrene hoặc polyacrylamide với các kích thước mắt lưới khác nhau. - Ứng dụng: phân tách các phân tử sinh học, xác định sự phân bố trọng lượng phân tử của protein và peptide cũng như để tách các polymer tan trong nước. 5 Các loại cột chuyên dụng khác - Sử dụng để phân tách các chất trong những ứng dụng cụ thể như: phân tích axít hữu cơ, chất nổ, dẫn xuất dinitrophenylhydrazine (DNPH) của aldehyde và ketone, thuốc trừ sâu carbamate… Các thông số của cột bao gồm: vật liệu nền pha tĩnh, chiều dài cột, cấu trúc vật liệu nhồi, đường kính trong, kích cỡ hạt nhồi, kích thước lỗ trống, khoảng pH hoạt động. Để lựa chọn được loại cột phù hợp nhất với mục đích phân tích, người phân tích cần phải cân nhắc nhiều yếu tố, trong đó có tính chất của chất cần phân tích để lựa chọn phương pháp phân tách phù hợp, tiếp theo đó là lựa chọn các thông số của cột phù hợp với chất cần phân tích. Thông thường không có một cột HPLC nào chính xác hoàn toàn với yêu cầu, nhưng luôn luôn có thể tìm được khá nhiều cột phù hợp cho mục đích phân tích riêng biệt. Hiện nay các nhà sản xuất đều đưa ra nhiều loạt cột phân tích dựa trên tiêu chuẩn USP, một trong số những trang web có thể giúp người mua dễ dàng lựa chọn cột theo các thông số mong muốn là https://www.analytics-shop.com/gb/hplc-column-configurator.html HPLC là một kỹ rất phân tích rất mạnh có thể dùng để phân tích rất nhiều loại mẫu khác nhau, dựa trên các cơ chế tách khác nhau và các loại cột phân tích khác nhau. Với tình hình hiện nay, có nhiều mẫu vắc xin và sinh phẩm cần phân tích bằng kỹ thuật HPLC, thì việc am hiểu về các cơ chế tách cũng như các loại cột sẽ giúp chúng ta có thể lựa chọn được phương pháp phân tích phù hợp. Nghiên cứu làm chủ được kỹ thuật này trong những năm sắp tới là một việc thiết thực với nhu cầu phát triển của Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin và sinh phẩm Y tế. |
